Este método pela primeira vez descreve procedimentos experimentais confiáveis para produção de proteína recombinante isento de metanol inducible eficiente em Pichia pastoris (Komagataella phaffii), empregando os promotores de fonte regulada de carbono P DCe PDF em experiências de pequena escala, enquanto o cultivo parâmetros podem ser monitorados on-line, e um feed de glicerol constante é aplicado.
O metanol é uma fonte de carbono bem estabelecida e indutor para a produção de proteína eficiente empregando Pichia pastoris (p. pastoris) como um host em escala micro, laboratório e industrial. No entanto, devido à sua toxicidade e inflamabilidade, há um desejo de evitar o metanol, mantendo a alta produtividade de p. pastoris. Cultivos de biorreator de pequena escala (0,5-5 volume de trabalho L) são comumente usados para avaliar uma estirpe e suas características de produção de proteína, pois microescala cultivo em placas de poço profundo pode ser mal controlado ou se baseia em um equipamento caro. Além disso, protocolos tradicionais para o cultivo e a indução de p. pastoris foram estabelecidos para indução de expressão ou metanol constitutiva e, até agora, que nenhum confiáveis protocolos foram descritos para a expressão de p. pastoris de tela cepas de derepressible promotores em cultivos paralelos (controlados e monitorados). Para simplificar esses cultivos iniciais para caracterizar e comparar novas cepas de produção de proteína, nós estabelecemos um sistema de cultivo de balão simples agitar para metanol livre expressão que simula condições de biorreator incluindo um glicerol lenta constante alimentar e monitoramento on-line, assim, aproximar-se às condições reais de biorreatores em comparação com cultivos de lote na maior parte aplicada em pequena escala. Para dirigir a expressão de proteínas recombinantes em p. pastoris, a fonte de carbono reprimida promotores PDC e PDF foram aplicados. Polímero discos com fonte de carbono incorporado, liberando uma quantidade constante de glicerol, garantida uma taxa de alimentação, fornecendo a energia necessária para manter os promotores ativo, mantendo a geração de biomassa baixa.
Melhoria no rendimento e condições de cultivo confiável em grande escala para a produção de proteínas recombinantes por microorganismos tais como bactérias ou fungos é uma das maiores necessidades de biotecnologia1 hoje e o sucesso comercial do industrial aplicações. Procedimentos de cultivo simples dueto e mídia, altos rendimentos e ferramentas bem caracterizadas2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) é uma levedura amplamente utilizada não convencionais para a produção de proteínas recombinantes. Ferramentas inovadoras adicionais são constantemente desenvolvidas para esta espécie, como novos vetores de expressão, incluindo novos promotores como alternativas para o amplamente utilizado PAOX1, na região promotora do álcool oxidase 1 gene3, 4,5. Um 500 bp longa sequência de DNA montante do gene CAT1 (CTA1) foi identificada como a região do promotor, que permite que uma nova estratégia de expressão livre de metanol e versátil em p. pastoris. O gene CAT1 é o gene da catalase única de p. pastoris e a proteína está localizada nos peroxissomos. A catalase desempenha um papel importante na desintoxicação de espécies reativas de oxigênio, que são decorrentes, por exemplo., da oxidação do metanol na via MUT Peroxissômicos ou durante a beta-oxidação de ácidos graxos6,7. A expressão do gene CAT1 é reprimida na presença de glicose ou de glicerol em meio de cultivo e derepressed após o esgotamento destes de fontes de carbono8. Além disso, a expressão do gene da catalase pode ser induzida com metanol e remarkebly também com ácido oleico, sendo aparentemente o único gene da via de p. pastoris MUT que pode ser induzida com ácido oleico mesmo a atingir níveis de expressão similar como com indução de metanol9.
O fragmento de bp 500 este promotor de p. pastoris CAT1 , que é chamado de PDC (às vezes também abreviado PCAT1-500), já foi testada para a produção de proteínas intracelular expressadas e secretadas e provou para ser um uma alternativa atraente para os clássico de dois promotores de p. pastoris – o forte constitutiva PGAP e o metanol inducible PAOX1, que foram desenvolvidos há mais de 20 anos. O PDC foi capaz de chegar a 21% (CalB) e 35% (HRP) das actividades volumétricas em comparação à PGAP em meio rico de açúcar. Após indução de metanol, o PDC não só respondeu mais rápido do que o de PAOX1, mas também claramente poderia superar isso por um 2,8 vezes maior título final do CalB9.
Além do PDC, um promotor de ortólogos (PDF) tinha sido identificado exibindo um perfil similar do regulamento. No entanto, é significativamente mais forte do que o PDC abaixo dos derepressed, bem como em induzida por metanol condições (manuscrito em preparação)3.
Em casos onde o forte constitutiva PGAP falhou devido a fisiologicamente problemático ou citotóxicos proteínas10,11, o PDC e o PDF representam uma alternativa ideal. Em experiências em micro escala, a expressão conduzida por estes promotores começa após o esgotamento da fonte de carbono inicial (ex., glicose ou glicerol), que facilita a produção de biomassa sem sobrecarregar as células com a superexpressão de a proteína recombinante desde o início. Enquanto ambos esses promotores são ainda inducible por metanol, a ativação por derepression faz uso adicional da fase preinduction, em comparação com as expressões empregando PAOX1. Além disso, o PDC e PDF podem ser usado para a produção de proteína livre de metanol, que é um objetivo desejável para grandes processos industriais12.
Para o desenvolvimento de cepas de produção aplicável e construções de expressão, várias etapas no desenvolvimento tem que ser passado a fim de estreitar-se de um grande número de transformants para o candidato preferido para aumentar. Sessões geralmente são realizadas em alto throughput em placas multi bem (micro escala: menos de 0,5 mL) a fim de capturar uma série de clones tão grandes quanto possível. Posterior re-seleção e re-re-screening são o próximo passo, seguido por shake de balão (pequena escala: 50-250 mL) ou (micro-) biorreator12sessões. No entanto, é desejável ter um método, que é a mais similar entre as diferentes escalas de centenas de microlitros em placas de poços profundos até vários mililitros em agitar frascos até mais tarde aumentar de produção livre de metanol em bem controlados biorreatores. Embora agitar frascos podem fornecer volumes já similares como biorreatores pequenos, existem várias limitações, que são altamente relevantes para a produção de proteína em larga escala como alimentação constante, aeração e monitoramento on-line13 de crescimento e suprimento de oxigênio. Empregando monitoramento óptico adaptado agitar frascos e agitação dispositivos fornecem uma alternativa econômica para o equipamento mais sofisticado para cultivo paralelo enquanto continua a fornecer tais como constantes on-line informações sobre parâmetros importantes da cultura biomassa e concentração de oxigénio dissolvido. Liberação lenta de fonte de carbono de transportadoras de polímero pode ser aplicada para garantir uma alimentação constante e controlada, sem depender de soluções técnicas complexas e dispositivos, simulando condições mais semelhantes de biorreatores do que simples plenamente aplicada anteriormente depleção de carbono fonte9,10, onde a energia para a expressão da proteína em curso torna-se limitando.
O método a seguir descreve um pequeno para expressão de proteínas livre de metanol controlável de média escala sistema em p. pastoris baseado em novos promotores PDC e PDF. Indução por derepression envolve duas fases. Uma primeira fase curta de acúmulo de biomassa sem a produção da proteína de interesse, usando uma fonte de carbono que reprime os promotores e uma segunda fase de produção de proteína alvo, onde uma fonte de carbono é fornecida em concentrações pequenas, mas constantes mantendo o promotor derepressed. Monitoramento on-line de parâmetros mais críticos do cultivo é aplicado durante o período inteiro de cultivo. O objetivo era fornecer um sistema de cultivo confiável e escalável, metanol livre para p. pastoris.
Esse método apresenta um protocolo confiável para metanol eficiente inducible expressão independente de p. pastoris como uma alternativa para expressão de proteínas de metanol clássica induzido impulsionado por PAOX112. Promotores de repressible, como o PDC, o PDF ou descrito anteriormente mutante PAOX1 variantes17, constroem a base molecular para este novo conceito de produção de proteína. Os mostrado resultados representativos sublinham a utilidade e a exequibilidade da expressão de proteínas recombinantes em p. pastoris pelos promotores de reprimida e triagem em pequena escala com simples monitoramento on-line. Por um lado, o metanol nocivo e tóxico que normalmente é usado para a indução do promotor AOX1 pode ser eliminado a partir do cultivo. Por outro lado, o crescimento e a fase de produção de proteína são desacopladas9 em contraste com a expressão de proteínas constitutivas, por exemplo., com o comumente usado PGAP. Isto é especialmente benéfico quando as células devem expressar proteínas tóxicas ou nocivas que exibem um fardo para eles.
A possibilidade de iniciar os cultivos com concentrações de fonte de carbono diferentes permite que a decisão de quanta biomassa um gostaria de ganhar antes da fase de produção de proteína começa. Ao escolher uma baixa concentração de fonte de carbono no lote, limitações de transferência de oxigênio devido a densidades de pilha demasiado elevada podem ser reduzidas, enquanto por outro lado maiores densidades de pilha também podem resultar em maior concentração de proteína. Ao monitorar o desenvolvimento da cultura em termos de geração de biomassa e as concentrações de oxigênio, o ponto ideal de tempo para iniciação alimentados em lotes pode ser determinado facilmente como é mostrado na Figura 1.
Para o monitoramento on-line desses parâmetros de cultivo, deve ser aplicado um sistema de medição adequados. A biomassa (por exemplo, SFR Vario) dispositivo de medição é um simples e sistema de medição on-line econômico para cultura monitoramento em agitar frascos. O leitor optoelectronic determina o crescimento de células no balão através de detecção de luz dispersa e lê o sinal do sensor de oxigênio, integrado no frasco. A ótica para medição de biomassa consistem de um LED que emite um sinal luminoso, que é espalhado por partículas (células) do caldo de cultura e detectado com um fotodiodo. Os sensores ópticos emitem fluorescência quando excitado com a luz de um determinado comprimento de onda. Dependendo da quantidade de moléculas do analito presentes, este sinal de fluorescência muda, que é detectado pela óptica do leitor e traduzida em valores de concentração. No entanto, uma calibração de medição de densidade celular tem que ser estabelecida previamente, desde que o sistema de medição não é medir valores de600 reais do OD. A taxa de absorção de oxigênio pode ser calculada a partir do declive da curva de oxigênio com o software do leitor, e a temperatura, bem como o rpm é registradas continuamente junto com os outros parâmetros. Para habilitar o monitoramento com este sistema, os frascos de agitação tem que anteriormente ser equipados com os sensores apropriados para os parâmetros desejados.
Pela adição de polímero de liberação lenta quatro discos fornecendo uma quantidade constante de glicerol para o caldo de cultura, acúmulo de biomassa está quase parado, e produção de proteína recombinante é continuada. A determinação do ponto de tempo de adição de disco feed não é um passo crítico neste experimento, mas deve-se considerar que um prematuro iniciar alimentação antes da fase de crescimento exponencial poderia ser inibindo a ativação do promotor, como a expressão começa em cima depleção de fonte de carbono. Além disso, o total de tempo devido às limitações de capacidade de polímero de alimentação pode ser reduzido, Considerando que atrasar o feed depois que as células têm atingido a fase estacionária pode levar à fome e degradação do já produzido proteína. A quantidade de alimentação discos utilizados neste protocolo foi determinada experimentalmente para a liberação de fonte de carbono ideal manter o promotor de reprimida, mantendo a geração de biomassa baixa (dados não mostrados). Desta forma, os cultivos podem ser realizados facilmente mais de 160-180 h sem qualquer intervenção.
Aplicações principais deste novo protocolo será no clone de expressão triagem, evolução de enzima e a descoberta, caracterização e engenharia de novos promotores empregando um protocolo de cultivo livre de metanol em condições bem monitorados. Em princípio, o mesmo protocolo deve ser aplicável para estratégias de alimentação misturado empregando metanol e feeds de fonte de carbono fermentativa limitado como descritos por Panula-Perälä et al. em 2014,18.
The authors have nothing to disclose.
ROBOX recebeu financiamento do projeto da União Europeia (UE) ROBOX (concessão acordo n ° 635734) sob o Horizonte 2020 programa de investigação e inovação da UE ações H2020-LEIT BIO-2014-1. As visões e opiniões aqui expressados são apenas dos autores e não refletem necessariamente aquelas da Agência de investigação da União Europeia. A União Europeia não é responsável por qualquer uso que pode ser feito das informações contidas neste documento.
A tese de doutorado de J. Fischer é co-financiado por uma concessão para “Industrienahe dissertação” da Agência de financiamento austríaco FFG.
Agradecemos Gernot John (PreSens GmbH) as discussões útil e valiosa contribuição para o projecto do manuscrito.
Bacto Yeast Extract | BD Biosciences | 212720 | |
Baffled Flask 250 mL | DWK Life Science | 212833655 | |
BBL Phytone Peptone | BD Biosciences | 298147 | |
BioPhotometer | Eppendorf AG | 5500-200-10 | |
Certoclav-EL | CertoClav GmbH | 9.842 014 | |
Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids | BD Biosciences | 291920 | |
Feed discs glycerol | Adolf Kuhner AG | 315060 | |
Glucose-monohydrate | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6887 | |
Glycerol ≥98 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3783 | |
K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6875 | |
KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904 | |
Multitron Standard | Infors AG | 444-4226 | |
SFR Vario v2 | PreSens GmbH | 200001689 |