メタノール・組成分析解消抑圧技術の採用によって独立式

1. メディアの準備 バッファーの最小媒体 (グリセロールと BMG、炭素源としてブドウ糖と BMD) 準備 (1 L) オートクレーブ 650 mL の蒸留水 1 L スクリュー キャップ ガラス瓶で。冷却後オートクレーブ 10 10 %w/v グルコースやグリセロール (目的の生成されたバイオマス量に応じて 30 100 mL、200 mL (1 M, pH 6) カリウム リン酸バッファーの YNB (134 グラム/L のイースト窒素塩基アミノ酸 w/o) 倍の 100 mL を追加して媒体を完成させます。ビオチン (10 mg/mL) ソリューションと滅菌で 1 L までフィル x 滅菌 500 の mL の 2 バッチ)、中に蒸留水。注: すべての成分は、別のフラスコでオートクレーブする必要があります。ビオチンは、オートクレーブときは、破棄され、したがって、0.2 μ m メンブレン フィルターで滅菌フィルターでなければなりません。 バッファーに格納されたリッチ ・ メディア (BYPG) (1 L) オートクレーブ 700 mL の蒸留水 1 L スクリュー キャップ ボトルで 1 w/v 酵母エキスと 2 %w/v ペプトンと。冷却後別にオートクレーブ 10 w/v グリセロール、カリウム リン酸バッファー (1 M, pH 6) の 200 mL の 30-100 mL を追加し、滅菌蒸留水 1 L を記入します。、 2. シェイク フラスコ準備 5 mL の蒸留水を加えて 250 mL 困惑してフラスコを振る、綿の布の 2 つの層でカバー、ゴムのバンドの場所でそれを修正します。アルミ箔の切れ端の布をカバーします。 オートクレーブによる殺菌のため 20 分の 121 ° C でフラスコ。 フラスコから事前に準備されたメディアの分注 50 mL 各フラスコに残留水を削除します。 3. 一晩培養接種 ふたは適切な通気できるように少し開いてそのまま YPD (1 w/v 酵母エキス、ペプトン 2 w/v、2 w/v グルコース) 50 mL の遠心管に 5 mL の目的の式ひずみの単一新鮮なコロニーで一晩かけて培養 (ONC) を開始します。 28 ° c、湿度 80%、100-130 rpm (振動直径 2.5 cm) でシェーカーで一晩育てましょう。 4. 測定セットアップおよび主な文化育成 オンライン監視システムを設定するのには、デバイスの適切な校正のための製造元の指示をに従ってください。 測定局に Bluetooth 接続の範囲を監視するための適切なソフトウェアがインストールされている、コンピューターを配置します。Bluetooth 経由でデバイスを接続するためのソフトウェアを起動します。 前面に銀色のボタンを押すことでバイオマス計測デバイスの Bluetooth 接続をオンに。 ソフトウェアで、デバイス、デバイスを検索をクリックします。注: デバイスがウィンドウ タスク行の下にリストとして表示されます。そうでない場合、バッテリが充電し、コンピューターが Bluetooth 接続の届くかどうかをチェックすることをお勧めします。 ドラッグし、画面測定トレイの右側にある正方形に発見されたデバイスをドロップします。 接続をクリックします。注: 接続が成功すると、管理画面が表示されます。 Bluetooth 接続の実行テストを開始するには、測定をクリックします。 実験を設定します。 測定を開始、実験の名前をクリックし、監視するために必要なすべてのパラメーターを有効にします。注: 可能な測定パラメーターのそれぞれのライセンスが必要です。 間隔を 3 分に設定します。注: 間隔を決定どのくらいの頻度測定ポイント取られ、すべての測定点の結果値にその後。1 分ごとの測定は非常に正確が評価するより面倒になる大量のデータが生成されます。 平均測定ポイントを 11 に設定します。注: この設定は、どのように多くの測定ポイントで 3 分ごと撮影実際に決定します。したがって、出力は 11 の測定ポイント以上 11 の平均値 s。 サンプルの名前を入力します。 角度が (手順 4.1) 前に既に校正された、次の画面をスキップします。注: 安定した接続と接続するコンピューターの適切な場所を確保するためには、テストの主な文化を接種する前に Bluetooth 接続の実行の使用をお勧めします。また、電池は、課金する必要があります。 波長 600 nm で分光光度計で培 (1:20) で希釈した ONC (ステップ 3.1) の細胞密度を測定します。媒体の 50 mL を接種する (炭素ソース濃度 0.3 1 をお勧めします %、異なるメディアできるだけ手順 1 で説明。) 次の計算を使って、0.05 の OD600 ONC と。 検出器に、フラスコを置き、28 ° C、130 rpm、80% の湿度で振る。注: それはフラスコの底に付着し、間違った値を降伏にセルを避けるために測定を開始する前に、文化の揺れの 5 分を与えることが非常に重要です。 ソフトウェアの測定を開始をクリックします。 0.2 mL のサンプルは、細胞密度の測定 4 h 炭素源を取得し、接種後枯渇 (決定手順 4.7) トリプリケートで。栽培メディア (最初の測定 1:5、第 2 測定 1:20) に適切なサンプルを希釈し、分光光度計で波長 600 nm の吸収を測定します。フラスコを削除する前に、シェーカーを停止する前にも、常にソフトウェアで計測を一時停止します。注: 検出器定義された振動条件下でパラメーターを記録するためにキャリブレーションが、ナンセンスの測定を行えば、まだ文化を記録するとき。また、常に再度測定を開始する前に揺れの 5 分を待機することを確認します。細胞密度の測定は、検出器はバイオマスと本物ではない細胞密度のちょうどの値を提供するために不可欠です。外径600値間キャリブレーション機能 (x 値) オンライン測定システム (y の値) によって得られた値はオンカラム縦長のいくつかを測定することによって実現できます。値は、次の校正機能によると対数の関係は線形ではないです。y: 分光光度計によって得られた外径600値x: オンライン計測システムによって得られた値k: 斜面d: 軸切片傾きと軸の切片は、対応する外径600値に任意の値を変換する使用できます。Excel で 1 つは同じ timepoint からオンライン システムからの値に対して得られた吸収スペクトルの測定外径600値をプロットできます。対数近似曲線と対応する方程式の追加は上記校正機能を与えます。 炭素源がほぼ枯渇した (約 12-20 h) までを栽培してください。そのため、酸素濃度がゼロに近づいているとセルが指数関数的成長段階にソフトウェア図で見ることができるまで、成長する文化をしましょう。注: これはこのプロトコルで使われる炭素ソース濃度のためのケースです。それにあるとおり exemplarily 代表結果セクションで図 1酸素レベルがゼロに近づくし、急激な成長にあるセルは、オンライン監視システムと炭素源の枯渇の timepoint を定めることが相。 5. 解消抑圧による発現 ステップ 4.6 で説明している timepoint に達したら、無菌条件下でフラスコあたり 4 つのフィード ディスクの追加によって文化を供給を開始します。注: 記載されている条件の下で 4 つのグリセロール フィード ディスク解放、メーカーによると 2 mg/h グリセリン。 サンプル選択法によるタンパク質の発現を監視するすべての 24 h をしながら 60-90 h の栽培を続ける (e.g。、ブラッドフォードの試金15, SDS ページの16または活動のアッセイ) と細胞密度測定。 6. 文化収穫 栽培の 60-90 h 後、50 mL 遠沈管 4,000 x g, 10 min. の 4 ° C での遠心分離によって収穫するために文化を記入します。注: (分泌蛋白質) の培養上清または (細胞内タンパク質発現) のセルは 4,000 x g, 10 min. の 4 ° C での遠心分離によって収穫できる、さらに解析を行うことができます。 さらに分析のソフトウェアからスプレッドシート ファイルとしてオンライン測定データをエクスポートします。 5-10 mL の蒸留水にすべてのフラスコと残りの細胞を不活化するオートクレーブをご記入ください。