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Bioengineering

Methanol unabhängigen Ausdruck von Pichia Pastoris de-Unterdrückung Technologien

Published: January 23, 2019
doi:
10.3791/58589
, , , ,
1bisy e.U., 2Institute of Molecular Biotechnology,Technical University of Graz

Summary

Diese Methode zum ersten Mal beschreibt zuverlässige experimentelle Verfahren zur effizienten induzierbaren Methanol-free rekombinanten Proteinproduktion in Pichia Pastoris (Komagataella Phaffii), beschäftigt die Kohlenstoff-Quelle reguliert Förderer P DCund P-DF in kleinem Maßstab Experimente beim Anbau Parameter online überwacht werden können, und ein konstanten Glycerin-Feed wird angewendet.

Abstract

Methanol ist ein gut etabliertes Kohlenstoffquelle und Induktor für effiziente Proteinproduktion Pichia Pastoris (p. Pastoris) als Gastgeber auf Mikro-, Labor und Industrie beschäftigt. Aufgrund seiner Toxizität und Entflammbarkeit ist jedoch ein Wunsch, Methanol unter Beibehaltung der hohen Produktivität der p. Pastoriszu vermeiden. Kleinen Maßstab Bioreaktor Bebauungen (0,5-5 L Arbeitsvolumen) werden häufig verwendet, um eine Belastung und seine Protein Produktionsmerkmale zu bewerten, da Microscale Anbau in Tiefbrunnen Platten kaum gesteuert werden oder stützt sich auf teure Ausrüstung. Darüber hinaus wurden traditionelle Protokolle für den Anbau und die Induktion von p. Pastoris für konstitutive Expression oder Methanol Induktion bisher gegründet und keine zuverlässige Protokolle zum Bildschirm p. Pastoris Ausdruck beschrieben wurden Stämme mit derepressible Promotoren in (kontrollierte und überwachte) parallele Kulturen. Um diese ersten Bebauungen zu charakterisieren und vergleichen neue Protein Produktionsstämme zu vereinfachen, haben wir ein einfaches Schütteln Kolben Anbausystem für Methanol freie Meinungsäußerung, die Bioreaktor-Bedingungen, einschließlich eine ständige langsame Glycerin feed simuliert und Online-Überwachung, damit Annäherung an die realen Bedingungen in Bioreaktoren im Vergleich zu den meist angewandten kleinen Batch Bebauungen. Rekombinante Proteinexpression in p. Pastoris die Kohlenstoffquelle Antrieb unterdrückt Promotoren PDC und PDF angewendet wurden. Polymer-discs mit eingebetteten Kohlenstoffquelle Freigabe eine konstante Menge von Glycerin, versichert eine Vorschubgeschwindigkeit liefert die notwendige Energie für die Aufrechterhaltung der Promotoren aktiv während die Biomasse-Generation gering zu halten.

Introduction

Verbesserung der Ausbeute und zuverlässige Anbaubedingungen im großen Maßstab für die Produktion von rekombinanten Proteinen durch Mikroorganismen wie Bakterien oder Hefe ist eines der wichtigsten Bedürfnisse der heutigen Biotechnologie1 und der kommerzielle Erfolg der industriellen Anwendungen. Dueto einfachen Anbau Verfahren und Medien, hohe Erträge und gut charakterisierten Werkzeuge2 Pichia Pastoris (Komagataella Phaffii) ist eine weit verbreitete nicht-konventionelle Hefe für Produktion rekombinanter Proteine. Zusätzliche innovative Werkzeuge werden ständig entwickelt für diese Spezies, wie neue Expressionsvektoren einschließlich neue Promoter als Alternative zu den weit verbreiteten PAOX1, der Promotor-Region des Alkohol Oxidase 1 gen3, 4,5. Eine 500 bp lange DNA-Sequenz stromaufwärts des Gens CAT1 (CTA1) war als Promotor-Region identifiziert, die eine neue Strategie der Methanol-freie und vielseitige Ausdruck in p. Pastorisermöglicht. Die CAT1 -gen ist das einzige Katalase-gen von p. Pastoris und das Protein befindet sich in den Peroxisomen. Die Katalase spielt eine wichtige Rolle in der Entgiftung von reaktiven Sauerstoffspezies, die entstehen, zB., durch Oxidation von Methanol in der peroxisomalen MUT Weg oder während der Beta-Oxidation von Fettsäuren6,7. Die Expression des Gens CAT1 ist in der Prescence der Glukose oder Glycerin im Anbau Medium unterdrückt und derepressed auf die Erschöpfung der diese Kohlenstoff-Quellen-8. Darüber hinaus kann die Expression des Gens Katalase induziert werden mit Methanol und Remarkebly auch mit Ölsäure, scheinbar wird das einzige gen des mit Ölsäure sogar Ausmaße ähnlichen Ausdruck als mit induziert werden kann p. Pastoris MUT-Signalwegs Methanol-Induktion-9.

Die 500 bp Fragment dieser p. Pastoris CAT1 -Promotor, der PDC (manchmal auch abgekürzt PCAT1-500) genannt wird, wurde bereits für die Produktion von intrazellulär ausgedrückt und sekretierten Proteine getestet und erwies sich als ein attraktive Alternative zu den beiden klassischen p. Pastoris Promotoren – die starken konstitutiven PLücke und das Methanol induzierbaren PAOX1, die vor mehr als 20 Jahren entwickelt wurden. Die P-DC konnte um 21 % (CalB) und 35 % (HRP) der volumetrischen Aktivitäten im Vergleich zu P-Lücke im Zucker Reich Medium zu erreichen. Auf Methanol Induktion PDC reagierte nicht nur schneller als die P-AOX1, aber könnte es durch eine 2,8 fach höhere abschließende Titer von CalB9auch deutlich übertreffen.

Neben dem PDCwar ein ortholog Promotor (PDF) zeigen ein ähnliche Verordnung Profil identifiziert worden. Es ist jedoch deutlich stärker als die PDC unter derepressed sowie unter Methanol-induzierten Bedingungen (Manuskript in Vorbereitung)3.

In Fällen, wo die starken konstitutiven PLücke aufgrund physiologisch problematische oder zytotoxische Proteine10,11fehlgeschlagen ist, repräsentieren die PDC und P-DF eine ideale Alternative. In Mikroskala Experimente, angetrieben durch diese Promotoren Ausdruck beginnt nach der Erschöpfung der ersten Kohlenstoffquelle (zB., Glukose oder Glycerin), die erleichtert die Produktion von Biomasse ohne Belastung der Zellen mit der Überexpression des das rekombinante Protein von Anfang an. Während beide dieser Promotoren noch induzierbaren von Methanol, die Aktivierung von Derepression macht zusätzliche Nutzung der preinduction Phase im Vergleich zu den Ausdrucksformen beschäftigen PAOX1. Darüber hinaus kann PDC und PDF für Methanol-freie Proteinproduktion verwendet werden ist ein erstrebenswertes Ziel für große industrielle Prozesse12.

Für die Entwicklung von anwendbaren Produktionsstämme und Ausdruck Konstrukten müssen mehrere Schritte in der Entwicklung bestanden werden, um zu den bevorzugten Kandidaten für Scale-Up von großen Zahlen der Transformanten einzugrenzen. Vorführungen sind in der Regel in hohem Durchsatz im Multi-well-Platten durchgeführt (Mikroebene: weniger als 0,5 mL) um eine Reihe von Klone so groß wie möglich zu erfassen. Anschließenden erneuten screening und re-re-screening ist der nächste Schritt, gefolgt von Shake Flask (kleinem Maßstab: 50-250 mL) oder (Mikro-) Bioreaktor Vorführungen12. Es ist jedoch wünschenswert, eine Methode, die zwischen den verschiedenen Skalen aus Hunderten von Mikrolitern in Deep-Well-Platten bis zu einigen Millilitern in Fläschchen schütteln bis zu späteren Scale-Up von Methanol-freie Produktion in gut kontrollierten am ähnlichsten ist Bioreaktoren. Obwohl schütteln Fläschchen bereits ähnliche Mengen als kleine Bioreaktoren liefern können, gibt es einige Einschränkungen, die für Protein-Produktion der großen Skala wie Konstante Fütterung, Belüftung und online-Überwachung13 des Wachstums von großer Bedeutung sind und die Versorgung mit Sauerstoff. Optische Überwachung beschäftigen angepasst Fläschchen schütteln und schütteln-Geräte stellen eine kostengünstige Alternative zum anspruchsvollere Ausrüstung für die parallele und trotzdem einen ständigen Online-Informationen über wichtige Kultur-Parameter wie Biomasse und gelöste Sauerstoffkonzentration. Langsamer Freisetzung von Kohlenstoffquelle aus Polymer Träger kann angewendet werden, um eine konstante und kontrollierte Futtermittel zu sichern, ohne auf komplexe technische Lösungen und Geräte simulieren mehr ähnliche Bedingungen von Bioreaktoren als bisher angewandten einfach voll Erschöpfung der Kohlenstoff-Quelle9,10, wo Energie für laufende Protein-Expression wird zu begrenzen.

Die folgende Methode beschreibt eine kleine bis mittlere Methanol frei steuerbare Proteinexpression System in p. Pastoris basierend auf die neue Promoter PDC und PDF. Induktion durch Derepression umfasst zwei Phasen. Eine erste kurze Phase der Biomasse Akkumulation ohne die Produktion des Proteins des Interesses, mit einer Kohlenstoffquelle, die unterdrückt die Promotoren und eine zweite Phase des Ziel-Protein-Produktion, wo eine Kohlenstoffquelle in kleinen, aber konstanten Konzentration zugeführt wird Aufrechterhaltung der Veranstalter derepressed. Online-monitoring der wichtigsten Parameter der Anbau wird während der ganze Anbau Zeit angewendet. Ziel war es, ein Methanol frei, zuverlässige und skalierbare Anbausystem für p. Pastoriszur Verfügung zu stellen.

Protocol

(1) Media-Vorbereitung Gepufferte minimal Medien (BMG mit Glycerin, BMD mit Traubenzucker als Kohlenstoffquelle) Vorbereitung (1 L) Autoklaven 650 mL destilliertem Wasser in einer Glasflasche 1 L Schraubverschluss. Nach dem Abkühlen vervollständigen Sie das Medium durch Zugabe von 100 mL autoklaviert 10 x YNB (134 g/L Hefe Stickstoff Basis w/o Aminosäuren), 200 mL Kalium-Phosphat-Puffer (1 M, pH 6), 30-100 mL 10 % w/V Glukose oder Glyzerin (abhängig von der gewünschten erzeugte Biomasse-Menge während die Charge) 2 mL steril 500 x Biotin (10 mg/mL) Lösung und füllen bis zu 1 L mit sterilem destilliertem Wasser.Hinweis: Alle Zutaten müssen in separaten Kolben autoklaviert werden. Biotin wird zerstört, wenn autoklaviert und muss daher der Filter mit 0,2 µm Membranfilter sterilisiert werden. Gepufferte rich-Media (BYPG) (1 L) Autoklaven 700 mL destilliertem Wasser mit 1 % w/V Hefe-Extrakt und 2 % w/V Pepton in eine 1 L-Schraubverschluss-Flasche. Nach dem Abkühlen fügen Sie 30-100 mL von dem getrennt autoklaviert 10 % w/V Glycerin, 200 mL Kalium-Phosphat-Puffer (1 M, pH 6) und füllen Sie bis zu 1 L mit sterilem destilliertem Wasser. 2. Schütteln Sie Fläschchen Vorbereitung Fügen Sie 5 mL destilliertes Wasser in der 250 mL ratlos Fläschchen schütteln, bedecken Sie es mit zwei Schichten aus Baumwolltuch und mit Gummibändern befestigen. Das Tuch mit einem Stück Alufolie abdecken. Autoklaven der Kolben bei 121 ° C für 20 min für vollständige Sterilisation. Entfernen Sie Restwasser aus der Flasche und aliquoten 50 mL der vorbereiteten Medien auf jedem Kolben. 3. Übernachtung Kultur Inokulation Starten Sie einer übernachten-Kultur (ONC) mit einer einzigen frischen Kolonie der gewünschte Ausdruck Belastung in 5 mL YPD (1 % w/V Hefeextrakt, 2 % w/V Pepton, Glukose 2 % w/V) in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen, wobei den Deckel leicht geöffnet, um ordnungsgemäße Belüftung zu ermöglichen. Lassen Sie es über Nacht bei 28 ° C, 80 % Luftfeuchtigkeit in einem Shaker mit 100-130 u/min (schütteln Durchmesser 2,5 cm) wachsen. 4. Messaufbau und wichtigsten Kultur-Anbau Folgen Sie für das Online-monitoring-System einrichten den Anweisungen des Herstellers für entsprechende Kalibrierung der Geräte. Platzieren Sie einen Computer, wo die entsprechende Software für die Überwachung im Bereich für eine Bluetooth-Verbindung zu den Messstationen installiert. Starten Sie die Software um die Geräte per Bluetooth zu verbinden. Schalten Sie die Bluetooth-Verbindung auf dem Biomasse-Messgerät mit der silbernen Taste auf der Vorderseite. Klicken Sie in der Software Geräte dann Geräte finden.Hinweis: Die Geräte sollten als Liste im Fenster unterhalb der Linie der Aufgabe angezeigt. Wenn sie dies nicht tun, ist es ratsam zu überprüfen, ob die Batterien aufgeladen sind und der Computer in greifbarer Nähe für eine Bluetooth-Verbindung ist. Drag & drop die gefundenen Geräte zu den Plätzen auf der rechten Seite des Bildschirms Messung Tablett. Klicken Sie auf verbinden.Hinweis: Wenn die Verbindung erfolgreich war, erscheint ein Bildschirm “Control”. Um einen Testlauf für die Bluetooth-Verbindung zu starten, klicken Sie auf die Messung. Richten Sie das Experiment. Klicken Sie auf Start-Messung, Name des Experiments und aktivieren Sie alle Parameter zur Überwachung benötigt.Hinweis: Für jede der möglichen gemessenen Parameter sind Lizenzen erforderlich. 3 min Intervall gesetzt.Hinweis: Das Intervall bestimmt, wie oft Messpunkte werden und jeder Messpunkt ergibt sich ein Wert danach. Jede Minute die Messung ist sehr genau, aber große Datenmengen werden generiert, wodurch es mehr mühsam zu bewerten. 11 Durchschnitt Messpunkte gesetzt.Hinweis: Diese Einstellung bestimmt, wie viele Messpunkte tatsächlich alle 3 min getroffen werden. Daher ist die Ausgabe der Mittelwert von 11 Messpunkten über 11 s. Geben Sie die Namen für die Proben. Überspringen Sie im nächsten Bildschirm, da der Winkel bereits vor (Schritt 4.1) kalibriert wurde.Hinweis: Ein Testlauf für die Bluetooth-Verbindung vor dem impfen die Hauptkulturen wird empfohlen, um stabile Verbindungen und entsprechenden Speicherort des angeschlossenen Computers zu gewährleisten. Darüber hinaus müssen die Batterien aufgeladen werden. Messen Sie die Zelldichte des ONC (Schritt 3.1) verdünnt in Anbau-Medien (01:20) in einem Spektrophotometer bei 600 nm Wellenlänge. 50 mL des Mediums zu impfen (empfohlene Quelle Kohlenstoffgehalt 0,3-1 %, andere Medien möglich wie in Schritt 1 beschrieben.) mit ONC auf einer OD600 von 0,05 mithilfe der folgenden Berechnung. Legen Sie die Kolben in die Detektoren und schütteln bei 28 ° C, 130 u/min und 80 % Luftfeuchtigkeit.Hinweis: Es ist sehr wichtig für die Kultur 5 min schütteln vor Beginn der Messung zu vermeiden Zellen kleben am Boden der Flasche und nachgiebig falsche Werte. Klicken Sie auf Start-Messung in der Software. 0,2 mL Proben nehmen, für Zelle Dichtemessung 4 h nach der Impfung und wenn die Kohlenstoffquelle wird erschöpft (Bestimmung im Schritt 4.7 beschrieben) in Triplicates. Verdünnen Sie die Proben entsprechend in Anbau-Medien (erste Messung 1:5, zweite Messung 01:20) und Messen Sie die Absorption bei 600 nm Wellenlänge in einem Spektrophotometer zu. Vor dem Entfernen der Flaschen und sogar vor dem Anhalten des Shakers immer halten Sie die Messung in der Software an.Hinweis: Die Detektoren sind für die Erfassung der Parameter unter definierten Bedingungen schütteln kalibriert und erbringt Unsinn Messungen bei der Aufnahme noch Kulturen. Stellen Sie außerdem sicher, immer 5 min vor Beginn der Messung wieder schütteln zu warten. Die Zelle Dichtemessungen sind unerlässlich, weil der Detektor nur Werte für die Biomasse und keine echten Zelldichte liefert. Eine Kalibrierfunktion zwischen die OD600 Werte (x-Werte) und die Werte, die durch das Online-Messsystem (y-Werte) erreicht werden, indem mehrere Zeitpunkte spektralphotometrisch gemessen. Die Werte sind nicht in einer linearen, sondern in einem logarithmischen Verhältnis entsprechend der folgenden Kalibrierfunktion:y: OD600 Werte erzielten Spektralphotometerx-Werte, die von Online-Mess-systemk: Hangd: Achse abfangenDie Neigung und die Achse abfangen lässt dann einen Wert in den entsprechenden OD600 Wert umzuwandeln. In Excel kann einer der spektralphotometrisch erhaltenen OD600 Werte gegen die Werte aus dem Online-System aus der gleichen Timepoint darstellen. Die Zugabe von einem logarithmischen Trendlinie und die entsprechende Gleichung geben die oben gezeigte Kalibrierfunktion. Pflegen Sie, bis die Kohlenstoffquelle ist fast erschöpft (ca. 12-20 Uhr). Lassen Sie zu diesem Zweck sich die Kulturen wachsen, bis es in den Software-Diagrammen ersichtlich, dass die Sauerstoffkonzentration sich Null nähert, und die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase sind.Hinweis: Dies ist der Fall für Kohlenstoff-Quelle-Konzentrationen, die in diesem Protokoll verwendet. Timepoint Kohlenstoff Quelle Erschöpfung kann mit der Online-monitoring-System ermittelt werden, wie es in Abbildung 1 im Abschnitt Vertreter Ergebnisse exemplarisch gezeigt wird, wenn der Sauerstoffgehalt gegen Null geht und die Zellen in das exponentielle Wachstum sind Phase. (5) Proteinexpression durch de-Unterdrückung Wenn die beschriebenen Schritt 4.6 Timepoint erreicht ist, beginnen Sie, Fütterung der Kulturen durch die Zugabe von vier Futtermittel Scheiben pro Flasche unter sterilen Bedingungen.Hinweis: Unter den beschriebenen Bedingungen vier Glycerin feed Scheiben lösen 2 mg/h Glycerin nach Angaben des Herstellers. Auch weiterhin den Anbau für 60-90 h während der Entnahme von Proben alle 24 h die Proteinexpression durch einen Test der Wahl überwachen (zB., Bradford-Test15, SDS PAGE16 oder Aktivität Assays) und Dichtemessungen Zelle. 6. Kultur Ernte Füllen Sie nach der 60-90 h des Anbaus die Kulturen in 50 mL Zentrifuge Röhren für die Ernte durch Zentrifugation bei 4.000 X g, 4 ° C für 10 Minuten.Hinweis: Der Überstand (für sekretierten Proteine) oder die Zellen (für intrazelluläre Protein-Expression) durch Zentrifugation bei 4.000 X g, 4 ° C für 10 min geerntet werden können und weitere Analysen durchgeführt werden können. Exportieren Sie die Online-Messdaten als eine Tabellenkalkulationsdatei von der Software zur weiteren Analyse. Füllen Sie ca. 5-10 mL destilliertem Wasser auf alle Flaschen und Autoklaven, die verbleibenden Zellen zu inaktivieren.

Representative Results

Wie im Abschnitt Protokoll beschrieben, kontrolliert die Software die wichtigen Anbau-Parameter über die gesamte Anbau. Abbildung 1 zeigt die Visualisierung von Biomasse Entwicklung und Sauerstoffkonzentration während ein Anbau begann mit 0,5 % (Abbildung 1A) oder 0,3 % (Abbildung 1 b) Kohlenstoffquelle im Batch gefolgt durch die Zugabe von Glycerin Scheiben zu ernähren. Das Online-monitoring-System eignet sich besonders für die de-unterdrückten Kulturen als Timepoint Kohlenstoff Quelle Erschöpfung nach der Partie genau bestimmt werden kann. Wie in Abbildung 1ersichtlich, ist der Sauerstoff-Konzentration im Medium schnell abnimmt und nähert sich Null, vor allem für 0,5 % Glycerin im Batch (Abbildung 1A) während die Biomasse zu diesem Zeitpunkt exponentiell zunimmt. Hier die Zellen sind in der exponentiellen Wachstumsphase und um optimale Nutzung der Kohlenstoff-Source-Version zu machen, kurz bevor die Kultur die stationäre Phase erreicht, die Futtermittel Scheiben hinzugefügt werden, wie es im Protokoll beschrieben wird. Die Zugabe der feed Scheiben bevor die Sauerstoffkonzentration Null erreicht ist wichtig für de-verdrängten Protein-Expression, die Zellen von Sauerstoff Einschränkung zu verhindern. Niedrigere Konzentrationen des Glycerins reduzieren die Wirkung der kurzfristigen Sauerstoff Einschränkungen wie es sieht man in Abbildung 1 b und sind daher für de-verdrängten Proteinexpression empfohlen. Im folgenden die Ergebnisse von zwei verschiedenen Anbau – Einsatz der beschriebenen Protokoll und das monitoring-System in Abbildung 1 gezeigt – Experimente beschrieben werden. Im ersten Experiment, eine p. Pastoris Sorte der Glukose-Oxidase aus Aspergillus Niger (A. Niger) unter der Kontrolle des PDC und im zweiten einen p. Pastoris Stamm produziert das menschliche Wachstumshormon unter Kontrolle des P-DF wird angezeigt. In diesem Experiment wurde Glukose-Oxidase-Produktion unter der Kontrolle der PDC untersucht. Daher wurden verschiedene Anbau Strategien verglichen: Glycerin zu pulsieren, konstante Glycerin durch Zugabe von feed-Discs und Anbau ohne jeden feed oder pulsierende ernähren. Der Anbau erfolgte in 50 mL gepufferten minimal Medien mit 0,5 % Glukose als einzige Kohlenstoffquelle in 250 mL schütteln Korbflaschen (Tabelle 1). Auf 160 h Anbau wurden die höchsten Konzentrationen von Biomasse gewonnen, wenn ein Fütterungsstrategie mit einem Glukose-Batch für Biomasse-Produktion (38 h) und Glycerin pulsieren (0,25 % w/V Glycerin nach 38 h, 61 h und 86 h Anbau) arbeitete (0,21 g/L gesamt sekretorischen Eiweiß, 8,4 U/mL). Obwohl eine 2-fold Reduktion der Biomasse-Konzentration und der Gesamtbetrag der sekretierten Proteine wurden erzielt, wenn der feed Festplatten nach 38 h Glukose Batch hinzugefügt wurden, war die volumetrische Aktivität noch 1 U/mL höher im Vergleich zu den Anbau mit Glycerin pulsieren . Dies bedeutet, dass eine erhebliche Menge an freigesetzten Protein nicht zur volumetrischen Aktivität im Überstand trägt und in eine inaktive Form abgesondert werden kann. Daher bevorzugen höhere Konzentrationen von Glycerin aus Glycerin Impulse scheinbar die Bildung von Biomasse anstelle von Ziel-Protein-Produktion und konstant niedrige Glycerin Veröffentlichung führte zu mehr als zwei-fach höhere spezifische Produktivität. Ein weiteres Experiment mit der de-unterdrückte Ausdruck Methode erfolgte durch das menschliche Wachstumshormon (hGH) unter Kontrolle des PDFzum Ausdruck zu bringen. Das Konstrukt wurde stabil in das Genom von p. Pastoris Stamm BSYBG11 integriert. Hier, 50 mL BYPG, gepuffert reichen Medium, in 250 mL Fläschchen schütteln ratlos mit 0,3 % (w/V) Glycerin als Kohlenstoffquelle im Batch verwendet wurde. Auf Glycerin Erschöpfung sorgte die Proteinexpression mit konstanter Glycerin füttern durch die Zugabe von 4 Scheiben pro Fläschchen zu füttern und im Vergleich zu ohne Glycerin feed (Abbildung 2). Abbildung 2 zeigt den Vergleich zwischen hGH Ausdruck und Biomasse Entwicklung der gleichen Sorte angebaut, mit und ohne ständige Glycerin zu ernähren. Als Test Sandwich ELISA diente mit dem sekundären Antikörper mit HRP verschmolzen und Erkennung mit 3,3′, 5, 5 ‘-Tetramethylbenzidine (TMB) als Substrat durchgeführt wurde. Speziell für dieses Protein, schien es so, dass ohne jede Fütterung, die Zellen beginnen sich zu produzierten Proteins nach ca. 30 h (leichte blaue Quadrate), beeinträchtigt durch die Fütterung, dieser Abbau werden könnte verhindert (dunkle blaue Dreiecke) und auch die Proteinkonzentration pro Biomasse erhöht noch nach 150 h des Anbaus. Wie bereits angemerkt für Hansenula Polymorpha14zeigt dieses Ergebnis, wie der Wechsel von Batch, wie es in der Regel in Shake Flask Skala, fed-Batch-Modus verwendet wird p. Pastoris Kultivierungen optimieren kann. Abbildung 1: Visualisierung von Online-Parameter während zwei Kulturen mit unterschiedlichen Glycerin Konzentrationen im Batch aufgenommen. Die Bebauungen begannen mit 0,5 % w/V (A) und 0,3 % w/V (B) Glycerin in der Charge, gefolgt von der de-Unterdrückung-Phase, wo wurden die Zellen durch die Anwendung 4 feed Disks pro Flasche gefüttert (Freigabe von 0,5 mg/h/disc nach Angaben des Herstellers). Die gestrichelten Linien zeigen die Sauerstoffkonzentration in der Mitte, während die durchgehende Linien die Zelldichte (OD600 zeigen). Fehlerbalken zeigen, dass die Standardabweichung der sechs repliziert (je 2 biologische, drei technische). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Vergleich der human Growth Hormon (hGH) Ausdruck im Batch und fed Batch Modus. hGH-Inhalt wird durch Absorptionswerte bei 405 nm von einem ELISA wo der 2Nd -Antikörper war eine HRP-Fusion und TMB diente als Substrat für die Erkennung. Gezeigt werden die Ergebnisse von zwei verschiedenen Kulturen: leichte blaue Linie und Plätze-Anzeige der Zelldichte und hGH-Konzentration durch die Zelldichten einer Kultur ohne jeden Feed nach dem Batch, im Vergleich zu einer Kultur, wo das Glycerin Scheiben füttern normiert wurden (dunkle blaue Linien und Dreiecke) angewendet. Fehlerbalken zeigen, dass die Standardabweichung der sechs repliziert (je 2 biologische, drei technische). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. PDC- GOX Anbau Zeitpunkt 160 h OD600 Bd. Aktivität [U/mL] Gesamtbetrag der sekretierten Proteine [mg/mL] volumetrische Aktivität pro Zelldichte Meine SD Meine SD Meine SD Meine BMD1 % Charge + Glycerin pulsieren 74,6 2 8.4 2.4 0.21 0,01 0,11 BMD1 % Charge + konstante Glycerin feed 32,5 0,3 9.4 0,7 0,09 0,01 0.29 BMD1 % Charge 18,8 0,6 3.7 0,7 0,01 0 0,2 Tabelle 1: Ergebnisse der Methanol unabhängige GOX Ausdruck unter der Kontrolle von de-verdrängten Promoter PDC .

Discussion

Diese Methode stellt ein zuverlässiges Protokoll für effiziente Methanol unabhängige induzierbaren Ausdruck von p. Pastoris als Alternative zum klassischen Methanol induziert Protein-Expression von P-AOX1–12angetrieben. De-tragen Promotoren, wie P-DC, PDF oder zuvor beschriebenen mutierte PAOX1 Varianten17, bauen die molekulare Basis für dieses neue Protein-Produktion-Konzept. Die gezeigte repräsentative Ergebnisse unterstreichen den nutzen und die Praktikabilität der rekombinante Proteinexpression in p. Pastoris durch de-verdrängten Promotoren und kleine Screening mit einfachen Online-Überwachung. Auf der einen Seite kann die schädliche und giftige Methanol, das in der Regel für die Induktion des AOX1 -Promotors verwendet wird vom Anbau beseitigt werden. Auf der anderen Seite sind das Wachstum und die Protein-Produktionsphase abgekoppelt9 im Gegensatz zu den konstitutiven Proteinexpression, zB., mit der häufig verwendeten PLücke. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn die Zellen giftigen oder schädlichen Proteine zum Ausdruck bringen sollte, die eine Belastung für sie anzeigen.

Die Möglichkeit, die Kulturen mit unterschiedlichen Kohlenstoff Quelle Konzentrationen starten kann die Entscheidung, wie viel Biomasse möchte man vor der Protein-Produktionsphase zu gewinnen beginnt. Bei der Wahl einer niedrigeren Kohlenstoffgehalt Quelle im Batch können Sauerstoff Transfer Einschränkungen aufgrund zu hohen Zelldichten reduziert werden, während auf der anderen Seite höhere Zelldichten auch höheren Protein-Titer führen können. Durch die Überwachung der Entwicklung der Kultur in Bezug auf die Erzeugung von Biomasse und Sauerstoffkonzentrationen, kann der optimale Zeitpunkt für die fed Batch Initiation leicht ermittelt werden, wie es in Abbildung 1dargestellt ist.

Zur Online-Überwachung dieser Parameter Anbau, sollte eine geeignete Mess-System angewendet werden. Die Biomasse Messgerät (z.B.SFR Vario) ist eine einfache und wirtschaftliche Online-Mess-System zur Überwachung der Kultur Fläschchen schütteln. Der opto-elektronischen Leser bestimmt Zellwachstum in den Kolben über vereinzelte Lichterkennung und liest das Signal von der Sauerstoff-Sensor in der Küvette integriert. Die Optik für Biomasse Messung bestehen aus einer LED, die ein Lichtsignal aussendet, die von Teilchen (Zellen) in der Kultur-Brühe gestreut und mit einer Photodiode detektiert. Die optischen Sensoren emittieren Fluoreszenz bei Erregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge. Abhängig von der Menge des Analyten Moleküle ändert diese Fluoreszenzsignal, die durch die Leser-Optik erkannt und übersetzt Konzentrationswerte. Eine Zelle Dichte Messung Kalibrierung muss jedoch im Voraus festgelegt werden, da das Messsystem nicht OD600 Istwerte misst. Die Sauerstoff-Aufnahme-Rate errechnet sich aus der Steigung der Kurve Sauerstoff mit der Reader-Software, und die Temperatur sowie u/min werden zusammen mit den anderen Parametern kontinuierlich aufgezeichnet. Um mit diesem System Überwachung zu ermöglichen, müssen die Fläschchen schütteln vorher mit den entsprechenden Sensoren für die gewünschten Parameter ausgestattet sein.

Durch die Zugabe von vier slow-Release Polymer Scheiben bieten eine konstante Menge des Glycerins, die Kultur-Brühe, Biomasse Akkumulation ist fast beendet, und Produktion rekombinanter Proteine wird fortgesetzt. Die Bestimmung der feed Scheibe zusätzlich Zeitpunkt ist kein entscheidender Schritt in diesem Experiment, aber es sollte berücksichtigt werden, dass ein vorzeitige feed Start vor der exponentiellen Wachstumsphase die Projektträger Aktivierung Hemmung könnte, wie der Ausdruck beginnt auf Kohlenstoff-Quelle Erschöpfung. Darüber hinaus kann die Summe Fütterung durch Polymer Kapazitätsbeschränkungen reduziert werden, während das Futter zu verzögern, nachdem die Zellen die stationäre Phase erreicht haben zu hungern könnte und Verschlechterung der bereits Protein produzierten. Die Menge an Futter Scheiben, die in diesem Protokoll verwendeten war experimentell ermittelt für die optimale CO2-Source-Version, der Veranstalter, de-Biomasse Generation niedrig (Daten nicht gezeigt) mit gedrückter unterdrückt zu halten. Auf diese Weise können die Bebauungen werden leicht über 160-180 h ohne Eingriff durchgeführt.

Hauptanwendungen des neuen Protokolls werden im Ausdruck Klon screening, Enzym Evolution und die Entdeckung, die Charakterisierung und Technik neue Promoter, die mit einem Methanol-freien Anbau-Protokoll in gut überwachten Bedingungen sein. Im Prinzip sollte das gleiche Protokoll für gemischt-Feed Strategien mit Methanol und begrenzte fermentative Kohlenstoff Quelle Feeds wie von Panula-Perälä Et al.beschrieben gelten. in 201418.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ROBOX wird finanziell von der Europäischen Union (EU) Projekt ROBOX (Grant Agreement n ° 635734) unter Horizont 2020 Programm Forschung und Innovation der EU Aktionen H2020-LEIT BIO-2014-1. Die Ansichten und Meinungen hier sind nur diejenigen der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die von der Agentur der Europäischen Union-Forschung. Die Europäische Union ist nicht haftbar für jegliche Verwendung der hierin enthaltenen Informationen.

Die Dissertation von J. Fischer wird durch einen Zuschuss für “Industrienahe Dissertation” der österreichischen Finanzierung Agentur FFG mitfinanziert.

Wir danken Gernot John (PreSens GmbH) für die hilfreiche Diskussionen und wertvollen Input für die Manuskript-Entwurf.

Materials

Bacto Yeast Extract BD Biosciences 212720
Baffled Flask 250 mL DWK Life Science 212833655
BBL Phytone Peptone BD Biosciences 298147
BioPhotometer Eppendorf AG 5500-200-10
Certoclav-EL CertoClav GmbH 9.842 014
Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids BD Biosciences 291920
Feed discs glycerol Adolf Kuhner AG 315060
Glucose-monohydrate Carl Roth GmbH + Co. KG 6887
Glycerol ≥98 % Carl Roth GmbH + Co. KG 3783
K2HPO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 6875
KH2PO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 3904
Multitron Standard  Infors AG 444-4226
SFR Vario v2 PreSens GmbH 200001689
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References

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Fischer, J. E., Hatzl, A., Weninger, A., Schmid, C., Glieder, A. Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies. J. Vis. Exp. (143), e58589, doi:10.3791/58589 (2019).
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