JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

De onafhankelijke expressie methanol door Pichia Pastoris ambtshalve repressie technologieën in dienst

Published: January 23, 2019
doi:
10.3791/58589
, , , ,
1bisy e.U., 2Institute of Molecular Biotechnology,Technical University of Graz

Summary

Deze methode voor het eerst beschrijft betrouwbare experimentele procedures voor efficiënte afleidbare methanol-vrije recombinante eiwitproductie in Pichia pastoris (Komagataella phaffii), met de koolstof bron geregeld initiatiefnemers P DCen PDF in kleine schaal experimenten terwijl teelt parameters kunnen online worden gecontroleerd, en een constante glycerol feed wordt toegepast.

Abstract

Methanol is een gevestigde koolstofbron inductor voor efficiënte eiwitproductie, Pichia pastoris (P. pastoris) in dienst als een host op micro-, lab en industriële schaal. Echter, vanwege de giftigheid en brandbaarheid is er een verlangen om te voorkomen dat methanol met behoud van de hoge productiviteit van P. pastoris. Kleinschalige bioreactor teelten (0.5-5 L werken volume) worden vaak gebruikt om te evalueren van een stam en de eiwit productie kenmerken omdat microscale teelt in diep goed platen nauwelijks kan worden gecontroleerd of afhankelijk van dure apparatuur. Bovendien, traditionele protocollen voor de teelt en de inductie van P. pastoris werden opgericht voor de constituerende expressie of methanol inductie en tot nu toe dat geen betrouwbare protocollen werden beschreven op scherm P. pastoris expressie stammen met derepressible initiatiefnemers in (gecontroleerde en bewaakte) parallelle teelten. Ter vereenvoudiging van deze eerste teelten te karakteriseren en vergelijken van nieuwe eiwit productie stammen, opgericht wij een eenvoudige schudden kolf Cultuurstelsel voor methanol vrije meningsuiting die simuleert bioreactor voorwaarden met inbegrip van een constante traag glycerol feed en online monitoring, daardoor komt dichter bij de werkelijke voorwaarden in bioreactoren in vergelijking met meestal toegepaste kleinschalige batch teelten. Onderdrukt de initiatiefnemers PDC en PDF werden toegepast om recombinant eiwit expressie in P. pastoris, de koolstofbron. Polymeer schijven met ingesloten koolstofbron, het vrijgeven van een constante hoeveelheid glycerol, verzekerd van een verwerkingsdebiet leveren de nodige energie voor het behoud van de initiatiefnemers actief terwijl de generatie biomassa laag.

Introduction

Verbetering van de opbrengst en betrouwbare teelt voorwaarden op grote schaal de productie van recombinante eiwitten door micro-organismen zoals bacteriën of de gist is één van de belangrijkste behoeften van de hedendaagse biotechnologie1 en het commerciële succes van industriële toepassingen. Dueto eenvoudige teelt procedures en media, hoge opbrengsten en goed gekarakteriseerd tools2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) is een veel gebruikte niet-conventionele gist voor productie van recombinante eiwitten. Extra innovatieve hulpmiddelen worden voortdurend ontwikkeld voor deze soorten, zoals de nieuwe expressievectoren, met inbegrip van nieuwe initiatiefnemers als alternatieven voor de meest gebruikte PAOX1, de regio van de promotor van de alcohol oxidase 1 gen3, 4,5. Een 500 bp lange DNA-sequentie stroomopwaarts van het gen CAT1 (CTA1) werd aangeduid als de promotor regio, waarmee een nieuwe strategie van de methanol-vrij en veelzijdige expressie in P. pastoris. Het gen CAT1 is het enige katalase-gen van P. pastoris en het eiwit ligt in de peroxisomen. De katalase speelt een belangrijke rol in de ontgifting van reactieve zuurstof soorten, die zijn ontstaan, bijv., van methanol oxidatie in de peroxisomal MUT traject of tijdens Bèta-oxidatie van vetzuren6,7. De uitdrukking van het gen CAT1 is onderdrukt in de prescence van glucose of glycerol in het teelt-medium en derepressed op de uitputting van deze koolstof bronnen8. Bovendien, de expressie van het katalase-gen kan worden opgewekt met methanol en remarkebly ook met oliezuur, schijnbaar wordt het enige gen van de P. pastoris MUT traject dat kan worden opgewekt met oliezuur zelfs bereiken van vergelijkbare niveaus van de expressie als met methanol inductie9.

De 500 bp fragment van de promotor van dit P. pastoris CAT1 , die heet PDC (soms ook afgekort PCAT1-500), is voor de productie van intracellulair uitgedrukt en secreted eiwitten reeds getest en bleek een aantrekkelijk alternatief voor de twee klassieke P. pastoris initiatiefnemers – de sterke constitutieve Pkloof en de methanol afleidbare PAOX1, die meer dan 20 jaar geleden werden ontwikkeld. De P-DC kon bereiken 21 (CalB) tot 35% (HRP) van de volumetrische activiteiten ten opzichte van de P-GAP in suiker rijk medium. Methanol inductie, de P-DC niet alleen sneller dan de PAOX1hebben gereageerd, maar kon ook duidelijk beter te presteren dan het door een hogere definitieve titer 2.8 vouwen van CalB9.

Naast de PDC, had de promotor van een orthologous (PDF) geïdentificeerd tentoonstellen van een soortgelijke verordening profiel. Het is echter aanzienlijk sterker dan de PDC onder derepressed, evenals onder het methanol-induced voorwaarden (manuscript in voorbereiding)3.

In gevallen waar de sterke constitutieve Pkloof is mislukt vanwege fysiologisch problematisch of cytotoxische eiwitten10,11, vormen de P-DC en de P-DF een ideaal alternatief. In micro schaal experimenten, de expressie gedreven door deze initiatiefnemers begint na de uitputting van de initiële koolstofbron (bv., glucose of glycerol), die de productie van biomassa zonder te belasten de cellen met de overexpressie van vergemakkelijkt de recombinant eiwit vanaf het begin. Terwijl deze initiatiefnemers allebei nog afleidbare door methanol, de activering door derepression maakt extra gebruik van de preinduction fase in vergelijking met de uitdrukkingen met PAOX1. Bovendien, de PDC en PDF kan worden gebruikt voor methanol-vrije eiwitproductie, dat een wenselijk doel voor grote industriële processen12 is.

Voor de ontwikkeling van de toepasselijke productie spanningen en expressie constructies hebben verschillende stappen in de ontwikkeling worden doorgegeven om gerichter van grote aantallen transformants aan de voorkeurskandidaat voor schaal-up. Vertoningen worden meestal uitgevoerd in hoge doorvoersnelheid in multi goed platen (micro schaal: minder dan 0,5 mL) om te vangen een aantal klonen zo groot mogelijk. Latere opnieuw screening en re-re-screening is de volgende stap, gevolgd door schudden kolf (kleine schaal: 50-250 mL) of (micro-) bioreactor screenings12. Het is echter wenselijk dat een methode, die best te vergelijken tussen de verschillende schalen uit honderden antigeendosis in diepe-Wells-platen tot enkele milliliter in shake kolven tot later schaal-up van de methanol-vrije productie in goed gecontroleerde is bioreactoren. Hoewel shake kolven al soortgelijke volumes als kleine bioreactoren bieden kunnen, er zijn verschillende beperkingen, die zeer relevant voor grootschalige productie van eiwitten zoals constante voeding, beluchting en online-monitoring13 van groei zijn en zuurstoftoevoer. Optische controle dienst aangepast shake kolven en schudden apparaten een kosteneffectief alternatief bieden voor meer geavanceerde apparatuur voor parallelle teelt terwijl nog steeds constant online informatie over belangrijke cultuur parameters zoals biomassa en gehalte aan opgeloste zuurstof. Langzaamwerkend van koolstofbron van polymeer dragers kan worden toegepast om een constante en gecontroleerde feed zonder te hoeven vertrouwen op complexe technische oplossingen en apparaten, meer gelijke concurrentievoorwaarden bioreactoren dan de eerder toegepaste eenvoudige volledige simuleren uitputting van koolstof bron9,10, waar energie voor lopende eiwit expressie wordt beperkt.

De volgende methode beschrijft een kleine tot middelgrote schaal methanol-vrije controleerbaar eiwit expressie systeem in P. pastoris gebaseerd op de initiatiefnemers van de nieuwe PDC en PDF. Inductie door derepression bestaat uit twee fasen. Een eerste korte fase van accumulatie van de biomassa zonder de productie van de proteïne van belang, met behulp van een koolstofbron die onderdrukt de initiatiefnemers en een tweede fase van de productie van de eiwitten van de doelgroep, waar een koolstofbron wordt geleverd in een kleine, maar constante concentratie behoud van de promotor derepressed. Online bewaking van meest kritieke parameters van de teelt wordt toegepast tijdens de hele teeltperiode. Het doel was om een methanol vrij, betrouwbare en schaalbare Cultuurstelsel voor P. pastoris.

Protocol

1. Media voorbereiding Gebufferde minimale media (BMG met glycerol, BMD met dextrose als koolstofbron) voorbereiding (1 L) Autoclaaf 650 mL gedestilleerd water in een fles van 1 L schroefdop. Na afkoeling, het medium te voltooien door toevoeging van 100 mL van gesteriliseerde met autoclaaf 10 x YNB (134 g/L gist stikstof base w/o aminozuren), 200 mL kalium fosfaatbuffer (1 M, pH 6), 30-100 mL 10% w/v glucose of glycerol (afhankelijk van het bedrag van de gewenste gegenereerde biomassa tijdens de batch), 2 mL steriele 500 x oplossing van Biotine (10 mg/mL) en vul tot 1 L met steriel gedistilleerd water.Opmerking: Alle ingrediënten moeten worden gesteriliseerde met autoclaaf in afzonderlijke kolven. Biotine bij gesteriliseerde met autoclaaf wordt vernietigd, en daarom moet worden gesteriliseerd met 0,2 µm membraanfilters filter. Gebufferde rijke media (BYPG) (1 L) Autoclaaf 700 mL gedestilleerd water met 1% w/v gist extract en 2% w/v pepton in een fles 1 L schroefdop. Na afkoeling, voeg de afzonderlijk gesteriliseerde met autoclaaf 10% w/v glycerol, 200 mL kalium fosfaatbuffer (1 M, pH 6) 30-100 mL en vul aan tot 1 liter met steriel gedistilleerd water. 2. schudden kolven voorbereiding Voeg 5 mL gedestilleerd water in de 250 mL verbijsterd schudden kolven, bedek het met twee lagen van de katoenen doek en repareren in plaats met elastiekjes. Betrekking hebben op de doek met een stuk aluminiumfolie. Autoclaaf de kolven bij 121 ° C gedurende 20 minuten voor volledige sterilisatie. Verwijder Residuele water van de kolf en aliquoot 50 mL van de eerder bereid media aan elke maatkolf. 3. ‘s nachts cultuur inoculatie Begin een overnachting cultuur (ONC) met een enkele vers kolonie van de stam van de gewenste expressie in 5 mL YPD (1% w/v gistextract, 2% w/v pepton, glucose 2% w/v) in een centrifugebuis 50 mL terwijl het deksel licht open om goede beluchting. Laat het groeien in de nacht bij 28 ° C, luchtvochtigheid van 80%, in een shaker bij 100-130 omwentelingen per minuut (2,5 cm schudden diameter). 4. meting Setup en belangrijkste cultuur teelt Voor het opzetten van de online monitoring systeem, volg de instructies van de fabrikant voor de juiste kalibratie van de apparaten. Plaats een computer, waar de juiste software voor het toezicht op is geïnstalleerd in bereik voor een Bluetooth-verbinding met de meetstations. Start de software om verbinding te maken met de apparaten via Bluetooth. De Bluetooth-verbinding op het meettoestel biomassa inschakelen door op de zilveren knop aan de voorzijde. In de software, klik op apparaten Apparaten vinden.Opmerking: De apparaten moeten worden weergegeven als een lijst in het venster onder de regel van de taak. Als dat niet het geval is, is het raadzaam om te controleren of de batterijen zijn opgeladen en de computer binnen handbereik voor een Bluetooth-verbinding is. Slepen en neerzetten van de gevonden apparaten op de vierkanten aan de rechterkant van het scherm Meting lade. Klik op verbinding maken.Opmerking: Wanneer de verbinding geslaagd is, een controle paneel scherm verschijnt. Om te beginnen een testlooppas voor de Bluetooth-verbinding, klikt u op meting. Het experiment instellen Klik op Start meting, naam het experiment en alle parameters die nodig zijn om te controleren inschakelen.Opmerking: Licenties nodig zijn voor elk van de mogelijke gemeten parameters. Interval instelt op 3 min.Opmerking: Het interval bepaalt hoe vaak meetpunten worden genomen en elk meetpunt resulteert in een waarde daarna. Het meten van elke minuut is zeer nauwkeurig, maar veel gegevens worden gegenereerd, waardoor het meer moeizaam te evalueren. Gemiddelde meetpunten ingesteld op 11.Opmerking: Deze instelling bepaalt hoeveel meetpunten zijn gehaald om 3 min. Dus de output is de gemiddelde waarde van de 11 meetpunten meer dan 11 s. Voer de namen voor de monsters. Sla het volgende scherm, zoals de hoek al voordat (stap 4.1 geijkt was).Opmerking: Een test voor de Bluetooth-verbinding vóór het enten van de belangrijkste culturen wordt geadviseerd om stabiele verbindingen en de juiste locatie van de aangesloten computer. Ook hebben de batterijen opgeladen te worden. Meet de celdichtheid van het ONC (stap 3.1) verdund in teelt media (1:20) in een spectrofotometer bij 600 nm golflengte. Inoculeer 50 mL van het medium (aanbevolen bron koolstofconcentratie 0,3-1%, verschillende media mogelijk zoals beschreven in stap 1.) met het ONC een OD600 van 0,05 met behulp van de volgende berekening. Plaats de kolven in de detectoren en schud bij 28 ° C en 130 rpm 80% vochtigheid.Opmerking: Het is zeer belangrijk dat de cultuur 5 min van schudden voordat begint de meting om te voorkomen dat cellen vasthouden aan de onderkant van de kolf en verkeerde waarden oplevert. Klik op Start meting in de software. 0,2 mL monsters nemen voor cel dichtheid meting 4 h na de inenting en wanneer de koolstofbron krijgt uitgeput (beschreven in stap 4.7 bepaling) in triplicates. Verdun de monsters op passende wijze in teelt media (eerste meting 1:5, tweede meting 1:20) en het meten van de absorptie bij golflengte van 600 nm in een spectrofotometer. Voor het verwijderen van de kolven en zelfs voordat u stopt de shaker, altijd pauzeren de meting in de software.Opmerking: De detectoren zijn gekalibreerd voor het opnemen van de parameters gedefinieerde schudden omstandigheden en naar onzin maten zal opleveren bij het opnemen van stilstaande culturen. Zorg er ook voor altijd wachten 5 minuten voordat u begint de meting opnieuw schudden. De cel dichtheid metingen zijn noodzakelijk omdat de detector is het leveren van alleen waarden voor de biomassa en de niet echte celdichtheid. Een calibratie functie tussen de OD-waarden voor600 (x-waarden) en de waarden die zijn verkregen door het online meetsysteem (y-waarden) kunnen worden bereikt door het meten van verschillende timepoints spectrophotometrically. De waarden zijn niet in een lineaire maar in een logaritmische relatie volgens de volgende kalibratiefunctie:y: OD-waarden van de600 verkregen door spectrofotometerx: waarden, verkregen door online meetsysteemk: hellingd: as snijpuntDe richtingscoëfficiënt en het snijpunt van de as kunnen vervolgens worden gebruikt voor het omzetten van elke waarde in de overeenkomstige waarde voor de OD-600 . In Excel kunt een het spectrophotometrically verkregen OD-600 -waarden tegen de waarden uit het online systeem van de dezelfde timepoint uitzetten. De toevoeging van een logaritmische trendlijn en de bijbehorende vergelijking zal de kalibratiefunctie hierboven. Cultiveren totdat de koolstofbron is bijna uitgeputte (app. 12-20 h). Te dien einde, laat de culturen groeien, totdat het kan worden gezien in de softwarediagrammen dat de zuurstofconcentratie nul nadert en de cellen in de fase van exponentiële groei zijn.Opmerking: Dit is het geval voor koolstof bron concentraties gebruikt in dit protocol. Het timepoint van koolstof bron uitputting kan worden bepaald met het online systeem van toezicht, zoals het is exemplarisch in Figuur 1 in de sectie vertegenwoordiger resultaten wanneer het zuurstofniveau nul benadert en de cellen in de exponentiële groei fase. 5. eiwit expressie door de repressie Wanneer het timepoint beschreven in stap 4.6 is bereikt, beginnen te eten van de culturen door de toevoeging van vier feed schijven per kolf onder steriele omstandigheden.Opmerking: Onder de beschreven omstandigheden, vier glycerol feed discs release 2 mg/h glycerol volgens de fabrikant. Blijven de teelt voor 60-90 h terwijl het nemen van monsters elke 24 uur om te controleren de eiwituitdrukking door een kwantitatieve analyse van keuze (bv., Bradford assay15, SDS-PAGE16 of activiteit testen) en cel dichtheid metingen. 6. cultuur oogsten Vul na de 60-90 h van de teelt, de culturen in 50 mL centrifuge buizen voor de oogst door centrifugeren 4000 x g4 ° C gedurende 10 minuten.Opmerking: Het supernatant (voor secreted eiwitten) of de cellen (voor de intracellulaire eiwituitdrukking) kunnen worden geoogst door centrifugeren 4000 x g4 ° C gedurende 10 minuten en verdere analyses kunnen worden gedaan. De online meting gegevens exporteren als een spreadsheet-bestand van de software voor verdere analyse. 5-10 mL gedestilleerd water aan alle kolven en autoclaaf voor inactivering van de resterende cellen vullen.

Representative Results

Zoals beschreven in de sectie protocol, registreert de software de teelt van belangrijke parameters in de hele teelt. Figuur 1 toont de visualisatie van biomassa ontwikkeling en zuurstofconcentratie tijdens een slag met 0,5% (figuur 1A) of 0,3% (figuur 1B) koolstofbron in de partij, gevolgd door de toevoeging van glycerol feed schijven teelt. Het online bewakingssysteem is vooral handig voor de-onderdrukte teelten als het timepoint van koolstof bron uitputting na de partij precies kan worden bepaald. Als het kan worden gezien in Figuur 1, is de zuurstofconcentratie in het medium snel afneemt en vrijwel nul te reduceren, vooral voor 0,5% glycerol in de batch (figuur 1A) terwijl de biomassa is op dit moment exponentieel toeneemt. Hier, de cellen zijn in de fase van exponentiële groei en optimale om gebruik te maken van de koolstof bron release, kort voordat de cultuur de stationaire fase, de feed schijven moeten worden toegevoegd, zoals wordt beschreven in het protocol. De toevoeging van de feed schijven voordat de zuurstofconcentratie nul is belangrijk voor de onderdrukte eiwit expressie om te voorkomen dat de cellen van zuurstof beperking. Concentraties die lager glycerol verminderen het effect van korte termijn zuurstof beperkingen als het kan worden gezien in figuur 1B en worden daarom aanbevolen voor de onderdrukte eiwit expressie. In de volgende, de resultaten van twee verschillende teelt – dienst het beschreven protocol en het monitoring systeem dat is afgebeeld in Figuur 1 – experimenten worden beschreven. Bij het eerste experiment, een stam van de P. pastoris produceren het glucose-oxidase van Aspergillus niger (A. niger) onder de controle van de P-DC en in de tweede een stam van de P. pastoris produceren van het menselijk groeihormoon onder controle van de P-DF wordt weergegeven. In dit experiment, werd glucose oxidase productie onder de controle van PDC onderzocht. Daarom verschillende teelt strategieën werden vergeleken: glycerol pulserende, constante glycerol voeden door toevoeging van diervoeders schijven en teelt zonder een feed of pulserende. De teelt werd gedaan in 50 mL gebufferd minimale media met 0,5% glucose als enige koolstofbron in flessen van 250 mL-shake (tabel 1). Op 160 h de teelt, de hoogste concentraties van biomassa zijn verkregen, wanneer een voeding strategie met behulp van een batch van glucose voor de productie van biomassa (38 h) en glycerol pulserende (0,25% w/v glycerol na 38 h, 61 h en 86 h teelt) werkte (0.21 g/L totaal secretoire eiwit, 8.4 U/mL). Hoewel een 2-fold verlaging van de concentratie van de biomassa en de totale hoeveelheid secreted eiwit werden verkregen, wanneer de feed schijven werden toegevoegd na 38 h glucose batch, was de volumetrische activiteit zelfs 1 U/mL hoger in vergelijking met de teelt met glycerol pulserende . Dit betekent dat een aanzienlijke hoeveelheid secreted eiwit draagt niet bij aan de volumetrische activiteit in het supernatant en in een inactieve vorm kan worden uitgescheiden. Daarom gunst hogere glycerol concentraties van glycerol pulsen schijnbaar de vorming van biomassa in plaats van doel eiwitproductie en constante lage glycerol vrijlating leidde tot meer dan twee-voudige hogere specifieke productiviteit. Een ander experiment de methode van de onderdrukte expressie in dienst werd gedaan door het uitdrukken van het menselijk groeihormoon (hGH) onder controle van PDF. De constructie was stabiel geïntegreerd in het genoom van P. pastoris stam BSYBG11. Hier 50 mL BYPG, gebufferde rijk medium, in 250 mL verbijsterd shake kolven met 0,3% (m/v) glycerol werd gebruikt als koolstofbron in de batch. Bij uitputting van glycerol, was de eiwituitdrukking met constante glycerol feed gewaarborgd door de toevoeging van 4 schijven per kolf voeden en in vergelijking met geen glycerol feed (Figuur 2). Figuur 2 geeft een vergelijking tussen hGH expressie en biomassa ontwikkeling van dezelfde stam geteeld met en zonder constant glycerol feed. Sandwich assay ELISA werd gebruikt met het secundaire antilichaam aan HRP gesmolten en detectie werd uitgevoerd met 3,3′, 5, 5 ‘-tetramethylbenzidine (TMB) als substraat. Vooral voor dit eiwit, het leek het geval dat zonder de eventuele toevoer, de cellen beginnen te degraderen van het geproduceerde eiwit na ongeveer 30 h (licht blauwe vierkantjes), dat door het voederen van dieren, deze aantasting kan worden voorkomen (donker blauwe driehoekjes) en zelfs de eiwitconcentratie per biomassa nog verhoogd na 150 h van de teelt. Zoals reeds waargenomen voor Hansenula polymorpha14toont dit resultaat aan hoe overschakelen van batch, zoals het meestal wordt gebruikt in schok kolf schaal, fed-batch modus kunt optimaliseren P. pastoris teelten. Figuur 1: visualisatie van online opgenomen parameters tijdens twee teelten met verschillende glycerol concentraties in de batch. De teelten werden gestart met 0,5% w/v (A) en 0,3% w/v (B) glycerol in de batch gevolgd door de fase van de onderdrukking waar de cellen werden gevoed door 4 feed schijven per kolf toe te passen (vrij tarief van 0,5 mg/h/disc volgens de fabrikant). De onderbroken lijnen tonen de zuurstofconcentratie in het medium, overwegende dat de ononderbroken lijnen de celdichtheid (OD600 tonen). Foutbalken geven dat de standaarddeviatie van zes repliceert (2 biologische, drie technische elk). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Afbeelding 2: vergelijking van menselijk groeihormoon (hGH) meningsuiting in batch en fed-batch modus. hGH inhoud wordt aangegeven door absorptie waarden op 405 nm door een ELISA waar het antilichaam 2nd was een HRP-fusion en TMB werd gebruikt als een basismateriaal voor detectie. Getoond worden de resultaten voor twee verschillende culturen: licht blauwe lijn en pleinen display de celdichtheid en hGH concentratie genormaliseerd door de dichtheid van de cel van een cultuur zonder alle diervoeders na de partij, in vergelijking met een cultuur, waar de glycerol schijven voeden waren toegepast (donker blauwe lijnen en driehoeken). Foutbalken geven dat de standaarddeviatie van zes repliceert (2 biologische, drie technische elk). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. PDC- GOX op 160 h teeltduur OD600 vol. activiteit [U/mL] totale hoeveelheid secreted eiwit [mg/mL] volumetrische activiteit per celdichtheid Gemiddelde SD Gemiddelde SD Gemiddelde SD Gemiddelde BMD1% batch + glycerol pulserende 74,6 2 8.4 2.4 0.21 0,01 0.11 BMD1% batch + constante glycerol feed 32,5 0.3 9.4 0,7 0.09 0,01 0,29 BMD1% batch 18,8 0.6 3.7 0,7 0,01 0 0.2 Tabel 1: resultaten van methanol onafhankelijke GOX expressie onder de controle van de-onderdrukte promotor PDC .

Discussion

Deze methode geeft een betrouwbaar protocol voor efficiënte methanol onafhankelijke afleidbare expressie door P. pastoris als alternatief voor de klassieke methanol geïnduceerde eiwituitdrukking gedreven door PAOX112. -Repressible initiatiefnemers, zoals de P-DC, de PDF of eerder beschreven gemuteerde PAOX1 varianten17, bouwen de moleculaire basis voor dit nieuwe concept van eiwit productie. De getoonde representatieve resultaten benadrukken het nut en de haalbaarheid van recombinant eiwit expressie in P. pastoris door-onderdrukte initiatiefnemers en kleinschalige screening met eenvoudige online monitoring. Aan de ene kant, kan de schadelijke en giftige methanol, die meestal wordt gebruikt voor de inductie van de promotor van de AOX1 worden geëlimineerd uit de teelt. Aan de andere kant, de groei en de fase van de eiwit-productie worden afgekoppeld9 in tegenstelling tot de constitutieve eiwit expressie, bijv., met de meest gebruikte Pkloof. Dit is vooral nuttig wanneer de cellen moeten uitdrukken toxische of schadelijke eiwitten die een last voor hen weergegeven.

De mogelijkheid om te beginnen de teelten met verschillende koolstof bron concentraties kan het besluit van hoeveel biomassa die men zou willen krijgen voordat de eiwit-productie-fase begint. Bij het kiezen van een lagere concentratie van koolstof bron in de batch, kunnen zuurstof overdracht beperkingen als gevolg van te hoge cel dichtheden worden verminderd, terwijl aan de andere kant hogere dichtheden van de cel ook in hogere eiwit titers resulteren kunnen. Door het toezicht op de ontwikkeling van de cultuur in termen van biomassa generatie en zuurstofconcentraties, kan het optimale tijdstip voor het initiëren van de fed-batch gemakkelijk zoals is aangetoond in Figuur 1worden bepaald.

Voor de online bewaking van de parameters van deze teelt, moet een passende meetsysteem worden toegepast. De biomassa meettoestel (b.v., SFR Vario) is een eenvoudige en economische online meet-systeem voor het toezicht op cultuur shake kolven. De opto-elektronische lezer bepaalt celgroei in de kolf via verstrooide licht detectie en leest het signaal van de lambdasonde geïntegreerd in de kolf. De optica voor meting van de biomassa bestaan uit een LED dat een lichtsignaal, die is verspreid door deeltjes (cellen) in de cultuur-Bouillon en met een fotodiode ontdekt uitzendt. De optische sensoren uitstoten fluorescentie wanneer opgewonden met licht van een bepaalde golflengte. Afhankelijk van de hoeveelheid analyt moleculen aanwezig verandert dit signaal van de fluorescentie, die is gedetecteerd door de lezer optica en vertaald in concentraties. Een cel kalibratie voor de meting van de dichtheid heeft echter vooraf, worden vastgesteld, aangezien het meetsysteem is niet het werkelijke OD600 waarden meten. De zuurstof opname snelheid kan worden berekend uit de helling van de curve van het zuurstof met de software van de lezer, en de temperatuur, alsmede de rpm voortdurend samen met de andere parameters worden geregistreerd. Als u wilt controleren met dit systeem, moeten de shake kolven eerder worden uitgerust met het passende sensoren voor de gewenste parameters.

Door de toevoeging van vier slow release polymeer schijven bieden een constante hoeveelheid glycerol aan de cultuur-Bouillon, biomassa accumulatie is bijna gestopt, en productie van recombinante eiwitten wordt voortgezet. De bepaling van het tijdstip van diervoeders schijf toevoeging is niet een cruciale stap in dit experiment, maar dit moet worden beschouwd dat een voortijdige feed start voordat de exponentiële groeifase kon worden remming van de promotor-activering als de expressie begint op koolstof bron uitputting. Bovendien, kan het totaal voedertijd als gevolg van polymeer capaciteit beperkingen worden verminderd, terwijl de feed vertraagd nadat de cellen hebben bereikt de stationaire fase tot honger leiden kan en afbraak van reeds opgeleverd eiwit. Het bedrag van diervoeders schijven gebruikt in dit protocol werd experimenteel bepaald voor de optimale koolstof bron release te houden van de promotor-onderdrukt terwijl biomassa generatie laag (gegevens niet worden weergegeven). Op deze manier de teelten kunnen worden uitgevoerd zonder tussenkomst van gemakkelijk meer dan 160-180 h.

Belangrijkste toepassingen van dit nieuwe protocol zullen in expressie kloon screening, enzym evolutie en de ontdekking, de karakterisering en de engineering van de initiatiefnemers van de nieuwe dienst een protocol van de methanol-vrije teelt onder goed gecontroleerde omstandigheden. In principe moet hetzelfde protocol gelden voor gemengd-feed strategieën methanol en beperkte fermenterende koolstof bron feeds zoals beschreven door Panula-Perälä et al.in dienst. in 201418.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ROBOX heeft financiering ontvangen van de Europese Unie (EU)-project ROBOX (subsidie overeenkomst n ° 635734) onder de Horizon 2020-programma onderzoek en de innovatie van EU acties H2020-LEIT BIO-2014-1. De standpunten en meningen hierin zijn alleen die van de auteur (s), en weerspiegelen niet noodzakelijk die van het Bureau van de Europese Unie-onderzoek. De Europese Unie is niet aansprakelijk voor enig gebruik dat kan worden gemaakt van de hierin opgenomen informatie.

De doctoraatsthesis van J. Fischer wordt mede gefinancierd door een subsidie voor “Industrienahe proefschrift” van de Oostenrijkse financiering agentschap FFG.

Wij danken Gernot John (PreSens GmbH) voor de nuttige discussies en waardevolle input voor het ontwerp van de manuscript.

Materials

Bacto Yeast Extract BD Biosciences 212720
Baffled Flask 250 mL DWK Life Science 212833655
BBL Phytone Peptone BD Biosciences 298147
BioPhotometer Eppendorf AG 5500-200-10
Certoclav-EL CertoClav GmbH 9.842 014
Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids BD Biosciences 291920
Feed discs glycerol Adolf Kuhner AG 315060
Glucose-monohydrate Carl Roth GmbH + Co. KG 6887
Glycerol ≥98 % Carl Roth GmbH + Co. KG 3783
K2HPO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 6875
KH2PO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 3904
Multitron Standard  Infors AG 444-4226
SFR Vario v2 PreSens GmbH 200001689
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bill, R. M. Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments. Frontiers in Microbiology. 5 (MAR), 1-5 (2005).
  2. Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris). Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).
  3. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  4. Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. Bidirectional Promoter. US patent. , (2005).
  5. Vogl, T., Glieder, A. Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production. New Biotechnology. 30 (4), 385-404 (2013).
  6. Rußmayer, H., et al. Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle. BMC Biology. 13 (1), 80 (2015).
  7. Sakai, Y., Yurimoto, H., Matsuo, H., Kato, N. Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii. Yeast. 14 (13), 1175-1187 (1998).
  8. Hartner, F. S., Glieder, A. Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. Microbial Cell Factories. 5, 39 (2006).
  9. Vogl, T., et al. A Toolbox of Diverse Promoters Related to Methanol Utilization: Functionally Verified Parts for Heterologous Pathway Expression in Pichia pastoris. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 172-186 (2016).
  10. Mellitzer, A., Weis, R., Glieder, A., Flicker, K. Expression of lignocellulolytic enzymes in Pichia pastoris. Microbial Cell Factories. 11 (1), 61 (2012).
  11. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  12. Weis, R., Luiten, R., Skranc, W., Schwab, H., Wubbolts, M., Glieder, A. Reliable high-throughput screening with Pichia pastoris by limiting yeast cell death phenomena. FEMS Yeast Research. 5 (2), 179-189 (2004).
  13. Ukkonen, K. . Improvement of Recombinant Protein Production in Shaken Cultures. , (2014).
  14. Jeude, M., et al. Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique. Biotechnology and Bioengineering. 95, 433-445 (2006).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  16. Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in molecular biology. 1, 41-55 (1984).
  17. Hartner, F. S., et al. Promoter Library Designed for Fine-Tuned Gene Expression in Pichia Pastoris. Nucleic Acids Research. 36 (12), e76 (2008).
  18. Panula-Perälä, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (7), 1261-1269 (2014).

Tags

Pichia PastorisMethanolDe-repressionRecombinant Protein ExpressionShake Flask CultivationOnline MonitoringBiomass MeasurementBluetoothCell DensityGlycerol FeedExponential Growth Phase

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fischer, J. E., Hatzl, A., Weninger, A., Schmid, C., Glieder, A. Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies. J. Vis. Exp. (143), e58589, doi:10.3791/58589 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image