Nasıl Photoactivated floresan proteinler toplu olarak ve canlı hücrelerdeki kısmını ölçmek için
Summary
Burada, genetik olarak eşleşmiş hayalice ayrı photoactivatable ve floresan proteinler içerir bir iletişim kuralı mevcut. Bu floresan protein chimeras miktar photoactivated Yani, floresan, olmak olduğunu PA-FP fraksiyonunun photoactivation verimliliği izin verir. Protokol photoactivation farklı modları farklı photoactivation verimliliği verim ortaya koymaktadır.
Abstract
Photoactivatable ve – Cabrio floresan proteinler (PA-FPs) Floresan yaşamak-cep mikroskobu içinde hücreleri ve protein topluluğu dinamiklerini analiz etmek için kullanılmaya başlandı. Şimdiye kadar herhangi bir yöntem toplu olarak ölçmek kullanılmaktadır ve PA-fps kaç ifade canlı hücreleri belli photoactivated vardır.
Burada, biz iç cetveller içeren bir protokolü mevcut, Yani, genetik olarak ratiometrically için hayalice farklı (photoactivatable) Floresan proteinler, birleşince tüm PA-FPs olması için açýk bir hücreye ifade kısmını ölçmek Floresan. Bu iletişim kuralını kullanan, gösterdiğimiz photoactivation farklı modları farklı photoactivation verimliliği vermiştir. Mikroskop (CLSM) tarama confocal lazer ile kısa yüksek güçlü photoactivation kadar dört kez daha düşük photoactivation verimliliği yüzlerce alt düzey Etkilenmeler CLSM tarafından uygulanan veya widefield aydınlatma tarafından uygulanan kısa bir darbe daha sonuçlandı. Protokol burada (PA-) GFP ve (PA-) kiraz için örneği iken, bu prensip olarak hayalice farklı herhangi bir photoactivatable veya photoconvertible floresan protein çifti ve deneysel herhangi bir kurulum için uygulanabilir.
Introduction
2002 yılında, ilk genel olarak uygulanabilir photoactivatable (PA-GFP1) ve photoconvertible (Kaede2) Floresan proteinler tarif edildi. Bu optik vurgulayıcı floresan proteinler UV-ışık, Yani, ışınlama üzerine spektral özellikleri değiştirmek onlar parlak hale (photoactivatable floresan proteinler, Yani, PA-kare/sn), onların rengi (photoconvertible veya değiştirme FPs). Bugüne kadar çeşitli geri dönüşümlü ve geri dönüşümsüz photoactivatable ve photoconvertible floresan proteinler Gelişmiş3,4olmuştur. Topluluk veya toplu çalışmalarda optik vurgulayıcılar tüm hücreleri veya proteinler dinamikleri ve hücre altı bölmeleri bağlantısı çalışmaya kullanılmaktadır. Ayrıca, etkin optik vurgulayıcılar tek-molekül superresolution PALM5 ve FPALM6gibi teknikleri Imaging temel.
Her ne kadar fotoğrafkimyasal işleme sırasında photoactivation veya – dönüşüm tarif edilmiş birçok optik vurgulayıcılar ve hatta crystallographic yapıları için önce ve photoactivation sonra / – dönüşüm kullanılabilir7 yaptı , 8, temel fotoğraffiziksel mekanizma photoactivation ve – dönüşüm değil tamamen anlaşılmaktadır. Ayrıca, şu ana kadar sadece kaba tahminler photoactivation ve – dönüşüm, verimliliğini, yani floresan proteinlerin kısmını var aslında photoconverted veya floresan olmak photoactivated. Vitro topluluğu çalışmaları soğurma spektrumları ve yerli miktarı vardiyada miktarının ve protein bir jel9,10,11‘ deki aktif bildirilmiştir.
Burada, photoactivated floresan proteinler toplu olarak ve canlı hücrelerdeki kısmını değerlendirmeye floresan protein chimeras içeren bir protokolü mevcut. Ne zaman genetik olarak kodlanmış floresan proteinler ile çalışma, protein ifade mutlak miktarı hücre hücre değişir ve bilinmiyor. Bir hücre bir PA-FP ifade photoactivation başka bir hücre daha sonra daha parlak bir sinyal gösteriyorsa, bu parlak sinyal PA-FP yüksek ifadesi veya PA-FP daha verimli bir photoactivation nedeniyle ise ayırt edemez. Hücreleri ifade kademede standartlaştırmak için genetik olarak eşleşmiş hayalice farklı floresan proteinlerin iç cetveller tanıtmak. Photoactivatable floresan protein bir hayalice farklı her zaman açık floresan proteinler, iç cetveller için genetik bilgi oluşturulur kaplin tarafından bu hala bir bilinmeyen toplam tutar ama sabit ve bilinen bir göreli miktarını belirtilecektir 1:1. Bu strateji farklı UV ışık photoactivation şemaları, Yani, nicel karakterizasyonu PA-FPs photoactivated photoactivation farklı mod ile olabilir ve böylece izin veriyorsa göreli miktarını değerlendirmesini sağlar diğerlerinden daha etkili photoactivation şemaları tanımlamak için. Ayrıca, bu strateji prensip olarak photoactivated PA-FP kesir mutlak miktar değerlendirmesini sağlar. Bu amaçla, sunulan topluluk çalışmalar analizi daha karmaşık bu protokol için düzenlendiği şekilde kılan Yoğunluk merkezli olduğunu fark önemlidir. Ölçülen floresan yoğunluğu, Yani, farklı moleküler parlaklık, absorbans ve emisyon spectra ve perde efektleri, belirleme parametrelerinin floresans yoğunluklarda farklı floresan proteinlerin karşılaştırırken dikkate alınması gerekir.
Sunulan ratiometric Yoğunluk merkezli miktar photoactivation verimlilik PA-GFP ve PA-kiraz canlı hücrelerdeki örneklenir ama genel olarak uygulanabilir ilke olarak ve herhangi bir photoactivatable floresan protein herhangi altında için kullanılan Deneysel durumu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Şimdiye kadar herhangi bir yöntem toplu olarak PA-canlı hücrelerde ifade photoactivated floresan olmak olan FPs kısmını belirlemek için var olmamıştır. Sunulan Protokolü herhangi bir hayalice farklı floresan protein çifti için kullanılabilir. PA-FPs PA-GFP ve PA-kiraz burada geri dönüşü olmayan örneği, bu yaklaşım ilke photoconvertible proteinler için de geçerlidir iken. Hayalice farklı floresan protein, ancak, dikkatli bir şekilde photoconvertible floresan proteinler onların absorbans ve emi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dorigo laboratuvar ve Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroloji Imaging servis ekipmanları ve mekan bu proje için sağlamak için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
References
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Day, R. N., Davidson, M. W. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. , 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
