Como quantificar a fração de proteínas fluorescentes fotoativo a granel e em células vivas
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo que envolve photoactivatable espectralmente distinto geneticamente acoplado e proteínas fluorescentes. Estas quimeras de proteína fluorescente permitam a quantificação da fração de PA-FP que é fotoativo ser fluorescente, ou seja, a eficiência de fotoativação. O protocolo revela que diferentes modos de fotoativação produzem photoactivation diferentes eficiências.
Abstract
Photoactivatable e – proteínas fluorescentes conversíveis (PA-FPs) têm sido utilizadas em microscopia de fluorescência viver-pilha para analisar a dinâmica das células e conjuntos de proteína. Até agora, nenhum método esteve disponível para quantificar a granel e em vivo células expressaram como muitos dos PA-FPs são fotoativo de fluorescência.
Aqui, apresentamos um protocolo envolvendo governantes internos, ou seja, geneticamente acoplado a proteínas fluorescentes espectralmente distintos (photoactivatable), a ratiometrically quantificar a fração de todos os PA-FPs expresso em uma célula que está ligado ao ser fluorescentes. Usando este protocolo, mostramos que os diferentes modos de fotoativação renderam photoactivation diferentes eficiências. Curto photoactivation de alta potência com um laser confocal microscópio (CLSM) resultou em até quatro vezes menor photoactivation eficiência do que centenas de exposições de baixo nível aplicadas por CLSM ou um pulso curto aplicado por widefield iluminação. Enquanto o protocolo tem sido exemplificado aqui para GFP (PA-) e Cherry (PA-), pode em princípio ser aplicado a qualquer par de proteína fluorescente de photoactivatable ou photoconvertible espectralmente distintas e qualquer montagem experimental.
Introduction
Em 2002, o primeiro photoactivatable amplamente aplicável (PA-GFP1) e photoconvertible (Kaede2) proteínas fluorescentes foram descritas. Estas proteínas fluorescentes marcador óptico alterar suas propriedades espectrais após irradiação com luz UV, ou seja, eles tornam-se brilhantes (proteínas fluorescentes photoactivatable, i.e., PA-FPs), ou alterar sua cor (photoconvertible FPs). Até à data, vários reversíveis e irreversíveis photoactivatable e photoconvertible proteínas fluorescentes foram desenvolvidos3,4. Em estudos de conjunto ou a granel, marcadores ópticos têm sido utilizados para estudar a dinâmica de células inteiras ou proteínas e a conectividade dos compartimentos subcellular. Além disso, único-molécula de marcadores ópticos habilitados com base superresolution de imagens técnicas como o PALM5 e FPALM6.
Embora a fotografiaquímica processa durante photoactivation ou – conversão foram descritos para muitos marcadores ópticos e estruturas cristalográficas mesmo antes e após a fotoativação / – conversão foram feitas disponíveis7 , 8, o mecanismofísico subjacente de foto de fotoativação e – conversão não é completamente compreendido. Além disso, até agora só brutas estimativas existem da eficiência de fotoativação e – conversão, ou seja, a fração de proteínas fluorescentes expressado ou seja realmente photoconverted ou fotoativados ser fluorescente. Foram relatados em vitro estudos ensemble quantificar a mudança em espectros de absorção e a quantidade de nativo e ativou a proteína em um gel de9,10,11.
Aqui, apresentamos um protocolo envolvendo quimeras de proteína fluorescente para avaliar a fração de proteínas fluorescentes fotoativo a granel e em células vivas. Sempre que trabalhar com proteínas fluorescentes geneticamente codificadas, a quantidade absoluta de proteínas expressada varia de célula para célula e é desconhecida. Se uma célula expressando um PA-FP mostra um sinal brilhante após a fotoativação do que outra célula, não podem ser diferenciado se este sinal mais brilhante é devido a maior expressão de PA-FP ou uma fotoativação mais eficiente do PA-FP. Para padronizar o nível de expressão nas células, nós introduzimos governantes internos de proteínas fluorescentes espectralmente distintas geneticamente acopladas. Por acoplamento a informação genética de uma proteína fluorescente photoactivatable para um espectralmente distintas sempre-em proteínas fluorescentes, governantes internos são criados que será ainda expressa para um total desconhecido, mas em uma fixa e conhecida a quantidade relativa de 1:1. essa estratégia permite a caracterização quantitativa da luz UV photoactivation esquemas, ou seja, a avaliação da quantidade relativa de PA-FPs, que pode ser fotoativados com diferentes modos de fotoativação e desse modo permite para definir o photoactivation regimes que são mais eficazes do que outros. Além disso, esta estratégia permite em princípio, a avaliação da quantificação absoluta da fração fotoativados PA-FP. Para este fim, é importante perceber que os estudos apresentados ensemble são baseados em intensidade o que torna a análise mais complexos, como previsto no presente protocolo. Parâmetros para determinar a intensidade fluorescente medida, ou seja, brilho molecular diferente, absorvância e espectros de emissão e FRET efeitos, precisam ser considerados ao comparar as intensidades de fluorescência das diferentes proteínas fluorescentes.
Ratiometric apresentado com base em intensidade quantificação dos photoactivation eficiência é exemplificada por PA-GFP e PA-cereja em células vivas, mas em princípio amplamente aplicável e pode ser usada para qualquer proteína fluorescente photoactivatable sob qualquer condição experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
Até agora, nenhum método existia para determinar a granel a fração de PA-FPs expressado em células vivas que é fotoativo ser fluorescente. O protocolo apresentado pode ser usado para qualquer par de proteína fluorescente espectralmente distintas. Enquanto aqui exemplificada para o irreversível FPs PA PA-GFP e PA-cereja, esta abordagem é, em princípio aplicável às proteínas photoconvertible também. A proteína fluorescente espectralmente distinta, no entanto, deve ser selecionada cuidadosamente para minimiza…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer o laboratório Dorigo e o serviço de Imaging neurociência na faculdade de medicina da Universidade de Stanford para fornecimento de equipamento e espaço para este projeto.
Materials
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
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