Wie den Anteil der photoaktiviert fluoreszierende Proteine in großen Mengen und in lebenden Zellen zu quantifizieren
Summary
Hier präsentieren wir eine Protokoll, die genetisch gekoppelten spektral unterschiedliche Photoactivatable und fluoreszierende Proteine beteiligt. Diese fluoreszierenden Proteins Chimären erlauben Quantifizierung der PA-FP-Fraktion, die photoaktiviert, fluoreszierende, d. h. die Photoaktivierungen Effizienz. Das Protokoll zeigt, dass verschiedene Modi der Photoaktivierungen verschiedenen Photoaktivierungen Effizienz ergeben.
Abstract
Photoactivatable und -Cabrio fluoreszierende Proteine (PA-FPs) haben im Leben-Zelle Fluoreszenzmikroskopie verwendet worden, für die Analyse der Dynamik der Zellen und Protein-Ensembles. Bisher keine Methode zur Verfügung, in der Masse zu quantifizieren und Live Zellen wie viele der PA-FPs ausgedrückt werden photoaktiviert zur Fluoreszenz.
Hier präsentieren wir ein Protokoll mit internen Herrscher, d. h. genetisch gekoppelten fluoreszierende Proteine spektral unterschiedliche (Photoactivatable), Ratiometrically den Anteil an alle PA-FPs ausgedrückt in einer Zelle, die eingeschaltet sind, zu quantifizieren fluoreszierende. Anhand dieses Protokolls zeigen wir, dass verschiedene Modi der Photoaktivierungen verschiedene Photoaktivierungen Effizienz erzielt. Kurze Hochleistungs-Photoaktivierungen mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (CLSM) führte bis zu viermal niedriger Photoaktivierungen Effizienz als Hunderte von Low-Level-Aufnahmen von CLSM angewendet oder ein kurzer Impuls von Weitfeld Beleuchtung angewendet. Während das Protokoll hier für GFP (PA-) und (PA)-Cherry veranschaulicht wurde, kann es im Prinzip jedes spektral unterschiedliche Photoactivatable oder Photoconvertible fluoreszierendes Protein-paar und jeder Versuchsanordnung angewendet werden.
Introduction
Im Jahr 2002 wurden die ersten breit anwendbar Photoactivatable (PA-GLP-1) und Photoconvertible (Kaede2) fluoreszierende Proteine beschrieben. Diese optische Textmarker fluoreszierende Proteine ändern ihre spektralen Eigenschaften nach Bestrahlung mit UV-Licht, d. h. sie werden hell (Photoactivatable fluoreszierende Proteine, z.B. PA-FPs) oder ändern ihre Farbe (Photoconvertible FPs). Bisher wurden mehrere reversible und irreversible Photoactivatable und Photoconvertible fluoreszierende Proteinen entwickelten3,4. In Ensemble oder Bulk Studien haben optische Textmarker verwendet wurde, um die Dynamik der ganze Zellen oder Proteine und subzelluläre Kompartimente-Konnektivität zu studieren. Darüber hinaus basiert optische Textmarker aktiviert Einzelmolekül-hochauflösendes bildgebende Verfahren wie PALM5 und FPALM6.
Obwohl die Foto-chemische während der Prozesse Photoaktivierungen oder -Konvertierung sind für viele optische Textmarker und sogar kristallographische Strukturen beschrieben worden, vor und nach der Photoaktivierungen / – Konvertierung zur Verfügung7 vorgenommen wurden , 8, der zugrunde liegenden Fotophysikalische Mechanismus des Photoaktivierungen und -Konvertierung wird nicht vollständig verstanden. Darüber hinaus bisher nur grobe Schätzungen existieren der Effizienz der Photoaktivierungen und -Konvertierung, d. h. den Anteil der fluoreszierenden Proteinen ausgedrückt, d. h. eigentlich Photoconverted oder photoaktiviert, fluoreszierend sein. In-vitro- Ensemble Studien haben berichtet worden, die Verschiebung der Absorptionsspektren und die Höhe der Native Quantifizierung und aktiviert Protein in einem Gel9,10,11.
Hier präsentieren wir ein Protokoll mit fluoreszierenden Proteins Chimären um den Bruchteil der photoaktiviert fluoreszierende Proteine in großen Mengen und in lebenden Zellen zu beurteilen. Wenn arbeiten mit genetisch codierte fluoreszierende Proteine, die absolute Menge an Protein ausgedrückt variiert von Zelle zu Zelle und ist unbekannt. Eine Zelle mit dem Ausdruck einer PA-FP zeigt ein heller Signal nach Photoaktivierungen als eine andere Zelle, kann nicht unterschieden werden, wenn diese hellere Signal aufgrund der höheren Ausdruck des PA-RP oder eine effizientere Photoaktivierungen des PA-RP ist. Um die Expression in Zellen zu standardisieren, führen wir interne Herrscher von genetisch gekoppelten spektral unterschiedliche fluoreszierende Proteine. Durch Kopplung die genetische Information eines Photoactivatable fluoreszierenden Proteins, ein spektral unterschiedliche immer auf fluoreszierende Proteine, interne Herrscher erstellt wird, noch eine unbekannte Gesamtbetrag, sondern in einem behobenen und bekannten relativen Zeitraum ausgedrückt werden 1: 1. diese Strategie ermöglicht der quantitative Charakterisierung der verschiedenen UV-Licht Photoaktivierungen Regelungen, d. h. die Bewertung der relativen Höhe der PA-FPs, die photoaktiviert mit verschiedenen Modi der Photoaktivierungen kann, und dadurch ermöglicht Photoaktivierungen Schemata definieren, die effektiver als andere sind. Darüber hinaus ermöglicht diese Strategie im Prinzip die absolute Quantifizierung der photoaktiviert PA-FP-Fraktion. Zu diesem Zweck ist es wichtig zu erkennen, dass die vorgestellten Ensemble Studien Intensität-basierte wodurch die Analyse komplexer, da in diesem Protokoll angelegt. Parameter bestimmen die gemessene Intensität der Fluoreszenz, d. h. unterschiedliche molekulare Helligkeit, Extinktion und Emissionsspektren und Bund Effekte, müssen berücksichtigt werden, beim Vergleich von Fluoreszenz-Intensität von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen.
Die vorgestellten ratiometrischen Intensität-basierte Quantifizierung der Photoaktivierungen Effizienz ist beispielhaft für PA-GFP und PA-Kirsche in lebenden Zellen, aber prinzipiell breit anwendbar und eignet sich für jede Photoactivatable fluoreszierendes Protein unter Versuchsbedingung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bisher gab es keine Methode, um in der Masse der Bruchteil der PA-FPs ausgedrückt in lebenden Zellen zu bestimmen, photoaktiviert fluoreszierend sein. Die vorgestellte Protokoll kann für jedes Paar spektral unterschiedliche fluoreszierenden Proteins verwendet werden. Während hier für die irreversible PA-FPs PA-GFP und PA-Cherry veranschaulicht, ist dieser Ansatz grundsätzlich für Proteine sowie Photoconvertible. Die spektral unterschiedliche fluoreszierenden Proteins muss jedoch sorgfältig ausgewählt werden, spek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten das Dorigo-Labor und den Neurowissenschaften Imaging Service an Stanford University School of Medicine danken für die Bereitstellung von Ausrüstung und Raum für dieses Projekt.
Materials
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
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