Capture et Identification des protéines de liaison à l’ARN à l’aide de Click chimie assistée par ARN-interactome Capture stratégie (CARIC)
Summary
Un protocole détaillé pour l’application de la clic chimie assistée par RNA-interactome capture (CARIC) stratégie pour identifier les protéines liant les deux codage et non codantes RNAs est présenté.
Abstract
Une identification complète des protéines de liaison à l’ARN (pratiques commerciales restrictives) est essentielle pour comprendre le réseau de régulation post-transcriptionnelle dans les cellules. Une stratégie largement utilisée pour la capture des RBP exploite la polyadénylation [poly (a)] de l’ARN cible, qui se produit principalement sur des ARNm eucaryotes matures, laissant la plupart des protéines liant de non-poly(A) ARN non identifiés. Nous décrivons ici les procédures détaillées d’une méthode récemment appelé clic chimie assistée par RNA-interactome capture (CARIC), qui permet la capture de transcriptome à l’échelle des pratiques commerciales restrictives des poly (a) et non-poly(A) en combinant le marquage métabolique de RNAs in vivo UV réticulation et marquage de bioorthogonal.
Introduction
Le génome humain est transcrite en différents types d’ARN codantes et non codantes (ncRNA), y compris les ARNm, rRNA, ARNt, petits ARN nucléaires (snRNA), petits ARN nucléolaires (ARNpno) et longtemps non-codage RNAs (lncRNAs)1. La plupart de ces ARN possède des vêtements des pratiques commerciales restrictives et fonction ribonucléoprotéique particules (RNP)2. Par conséquent, une identification complète des pratiques commerciales restrictives est une condition sine qua non pour comprendre le réseau de régulation entre les ARN et les pratiques commerciales restrictives, qui est impliqué dans diverses maladies humaines3,4,5.
Ces dernières années ont vu un grand élan de pratiques commerciales restrictives découvert dans divers systèmes eucaryotes2,6, y compris humaine7,8,9,10,11, souris12,13,14, levure9,15,16, zebrafish17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22et parasites de l’homme23,24,25 . Ces avances ont été facilitées par une stratégie de capture RBP développé par Castello et al. 7 et Baltz et al. 8 en 2012, qui combine en vivo UV réticulation des ARN et ses protéines qui interagissent, oligo (décollement) capture des poly RNAs et spectrométrie de masse (MS)-base de profilage protéomique. Toutefois, compte tenu du fait que poly (a) existe pour la plupart sur l’ARNm mature, qui représentent seulement environ 3 % – 5 % du transcriptome eucaryotes26, cette stratégie largement utilisée n’est pas capable de capturer des pratiques commerciales restrictives interagissant avec non-poly(A) ARN, dont la plupart ncRNA et pré-ARNm.
Nous rapportons ici les modalités d’une stratégie développée récemment pour la capture de l’échelle du transcriptome de pratiques commerciales restrictives à la poly (a) et non-poly(A)27. Appelé CARIC, cette stratégie combine en vivo UV réticulation et marquage métabolique d’ARN avec photoactivatable et « cliquables » analogues nucléosidiques (qui contiennent un groupe fonctionnel bioorthogonal pouvant participer à la réaction de clic), 4 – thiouridine (4SU) et 5-ethynyluridine (UE). Les étapes indispensables pour obtenir des résultats idéales avec la stratégie CARIC sont marquage métabolique efficace, réaction de réticulation et cliquez sur UV et le maintien de l’intégrité de la RNA. Cu (i) utilisé comme catalyseur dans la réaction de clic peut provoquer la fragmentation du RNAs, un ligand de Cu (i) qui peut de réduire la fragmentation de RNA est essentiel. Nous décrivons comment effectuer des réactions efficaces cliquez dans les lysats cellulaires sans causer de grave dégradation de l’ARN.
Bien que RBP capture et identification dans les cellules HeLa seulement est décrite dans le présent protocole, la CARIC stratégie peut être appliquée à différents types de cellules et éventuellement aux organismes vivants. En plus de la capture de la RBP, ce protocole prévoit également simplifiée des procédures pas à pas pour la préparation de l’échantillon MS et identification des protéines et la quantification, qui peut être utile pour ceux qui ne connaissent pas proteomic expériences.
Protocol
Representative Results
Discussion
La préservation de l’intégrité de RNA juste est l’une des clés du succès CARIC expériences. Dégradation de l’ARN peut être significativement réduite avec les ligands appropriés de Cu (i) et opération minutieuse, bien qu’on observe une dégradation partielle. Les ratios de substitution d’UE et 4SU en échantillons expérimentaux sont 1,18 % et 0,46 %, respectivement (données non présentées). Pour ARN intact d’une longueur de 2 000 nt, environ 90 % des ARN contiennent au moins une UE et un 4SU. Po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par la National Natural Science Foundation de Chine subventions 91753206, 21425204 et 21521003 et par le National clé de recherche et projet de développement 2016YFA0501500.
Materials
| HeLa | ATCC | ||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Penicillin & Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| EU (5-ethynyl uridine) | Wuhu Huaren Co. | CAS:69075-42-9 | |
| 4SU (4-thiouridine) | Sigma Aldrich | T4509 | |
| 10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| UV cross-linker | UVP | CL-1000 | Equiped with 365-nm UV lamp |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma Aldrich | D5758 | To treat water. Highly toxic! |
| Tris·HCl, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
| Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 88265 | One tablet for 50 mL lysis buffer. |
| LDS (Lithium dodecyl sulfate) | Sigma Aldrich | L9781 | |
| 15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC901024 | |
| 0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC501096 | |
| Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 41639 | |
| Azide-biotin | Click Chemistry Tools | AZ104 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] | Sigma Aldrich | 762342 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Azide-Cy5 | Click Chemistry Tools | AZ118 | |
| LDS sample buffer (4×) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| 10% bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
| SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] | J&K | 315442 | |
| Triethanolamine | Sigma Aldrich | V900257 | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma Aldrich | 61743 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | 30970 | |
| MaxQuant | Version: 1.5.5.1 |
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