新生儿多药脓毒症的对照小鼠模型

该议定书中的所有实验都已得到不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会根据 a17-0110 号议定书进行的批准。 1. 工具灭菌 在生物安全柜 (bsc) 中, 打开热珠灭菌器并将其预热至 250°c, 使用前至少30分钟。 将工具浸入70% 乙醇中。 将工具浸入预热的热珠灭菌器中至少1分钟。注: 工具的手柄将变热, 如果留在热珠消毒器中超过1.5 分钟, 可能会燃烧。 用70% 乙醇喷洒一大席纸巾进行消毒。 从热珠消毒器中取出工具, 而不将工具的灭菌部分接触到其他浸入水下工具的非无菌手柄上, 并将其放置在喷洒乙醇的纸巾上。 等待30秒到 2分钟, 让工具冷却, 然后再使用它们进行解剖。 2. cencal 浆料制备 预称15毫升离心管 (每5只老鼠为一管被安乐死)。 根据当地动物护理指南或使用以下协议对盲肠浆料捐献者进行安乐死。注: 6至12周大的多达 40只 c57bl/6j 小鼠被用于 cecal 浆液制备, 每次最多5只小鼠被安乐死。 将小鼠转移到安乐死室, 并将异氟醚麻醉机放入 5%, 并进行氧气灌注。 监测小鼠的移动能力丧失, 看到它们进入麻醉的手术平面, 最后停止呼吸。 将鼠标从安乐死室取出, 捏它的爪子, 观察任何腿部收缩或吸入。如果存在其中任何一个, 则将鼠标返回安乐死室; 如果存在, 则将鼠标返回到安乐死室。否则, 请继续。 最终通过尖锐的颈椎脱位对小鼠实施安乐死。 使用 bsc 中的预灭菌和冷却工具 (见第1节) 进行 cecum 解剖。 将鼠标的腿钉在挤出的聚苯乙烯泡沫板上, 使用 23 g 针, 使老鼠的腹部向上。用70% 的乙醇固定腹部, 然后喷洒。 使用无菌钳和剪刀, 穿过皮肤, 用剪刀从腹膜衬里放松皮肤, 并切开一个长方形区域, 从腹股沟到胸骨, 从左侧到右侧。从腹膜中取出任何毛皮。 切换到一对新的无菌工具, 以切割通过腹膜, 使一个矩形开放, 因为做的皮肤, 切换工具, 如果使用的接触皮肤。 识别塞子, 它应该在身体上从左到右运行。破裂的结缔组织, 以识别从肠道的仙人掌分支, 并切断从肠道的仙人掌。将塞康放在经过消毒的称重纸上。注: 称重纸可以通过在两侧喷洒70% 的乙醇并使其干燥或紫外线照射来消毒。或者, 可在无菌的 petri 板上解剖胎粪。 盲肠含量挤出 在平衡计分卡中, 使用无菌工具切割出胎粪的两端。 用无菌钳将胎粪中央按住, 并使用扁平的无菌金属铲子轻轻将仙人掌内的内容物从切割端推出, 使用滚动运动, 避免可能撕裂上皮的刮擦运动。收集内容物并将其放入预压15毫升离心管中。 将最多5只老鼠的仙人掌内的物质含量池入同一根管子中。一旦添加了所有的内容, 再称重管。注: 预计平均每只小鼠300毫克, 最高390毫克的仙人掌浆, 每只小鼠需要1.8 至2.4 毫升的 d5w 才能重新悬浮;因此, 在此步骤中使用5只以上的小鼠可能会导致15毫升离心管的过量填充。 用乙醇喷纸油条擦拭工具, 重复步骤 1.2-1.6 对其进行再消毒。 塞卡尔浆料过滤 称量充满冰囊内装物的离心管, 并通过将冰囊内装物的重量除以所需的每毫升库存浓度来计算到可得中的 d5w 的含量, 如下面的公式所示。 在 bsc 中, 在含有冰囊含量的15毫升离心管中加入所需的冰凉 d5w。 将15毫升的离心管垂直和水平旋转 30秒. 检查直径超过1-3 毫米的颗粒, 如果存在, 继续涡旋, 直到所有大颗粒明显消失。 将无菌的70μm 细胞过滤器放入放置在冰上的50毫升离心管中。将移液器重新悬浮在细胞过滤器中, 然后进入收集管。通过上下移液2x-3x 重新移出颗粒。轻轻挤压气泡以提高过滤速度, 同时用移液器尖端搅拌内容物, 直到没有更多的液滴被过滤。注: 混合时, 可能有足够大的颗粒来堵塞5毫升移液器。在这种情况下, 重复从步骤2.5.3 的涡流, 如果溶液仍然没有破裂, 使用移液器将颗粒压在离心管壁上。 重复步骤 2.5.4, 在每根冰浆管之间更换细胞过滤器, 并将所有内容物集中到保存在冰上的同一50毫升离心机收集管中, 如果滤液的体积超过冰箱中的冰水平, 则放入第二台50毫升离心管中。 将仙人掌浆液。 如果适用, 将多个50毫升的塞勒浆料滤液管从一步2.5.5 合并到一个更大的无菌容器 (例如, 1, 000 毫升的储存瓶) 中。然后, 涡旋 15秒, 并将20毫升放入一个新的50毫升离心管。 涡旋在50毫升离心管中5-10 的 cecal 浆料库存, 并将500μl 置于三个具有橡胶密封的2毫升低温瓶中, 以防止随着时间的推移蒸发。立即将主库存和上市的低温小瓶放在冰上。 重复步骤2.6.1 和 2.6.2, 直到所有的冰囊浆料都已被报价, 每三个低温小瓶后对主库存进行涡流处理, 以防止任何颗粒的沉淀, 并保持均匀的混合物。 将仙人掌冷冻。注: 每个成年小鼠的每只小瓶价格为 500μl, 预计可容纳3至4个小瓶。每个小瓶应该大致足以挑战一个垃圾的八只老鼠在 dol 7。 3. 7天龄新生小鼠脓毒症的挑战 分离、识别和称重新生鼠。 在 bsc 中, 将新生鼠转移到一个新的笼子里, 以防止老鼠远离大坝, 并减轻对大坝的压力。 取下用手套擦拭部分嵌套材料, 将笼子的气味转移到手套上。然后, 将筑巢材料塑造成一个较小的鸟巢, 并将其放置在没有大坝的新笼子中。 将新生小鼠转移到新笼子中的筑巢材料中。 转移更多的筑巢材料, 使第二个空巢在新的笼子。 关闭并将大坝的笼子从引擎盖上取下, 这样大坝就不会因为听到任何新生老鼠的痛苦而受到压力。 要在一段时间内跟踪垃圾中的单个新生小鼠, 请使用防乙醇标记标记尾巴前部或背面的1到5个点, 根据需要每12-24小时重新涂抹一次。 称重每只会被挑战的老鼠, 称重后将每只老鼠放入次巢, 并对所有老鼠重复此操作。 在准备可排浆料挑战之前, 把所有的垃圾送回大坝。 使用下面的计算或使用提供的工作表, 分别完成每个垃圾的此步骤, 计算 cecal 浆料的个别重量调整剂量和 d5w 所需的稀释量 (请参阅补充文件)。 计算每只老鼠要给其施用的 cecal 浆 (a) 的毫克, 方法是将小鼠的重量 (克 (b) 乘以所需的挑战剂量 (每克小鼠 (c) 的越周液毫克。 通过将每只小鼠所需的冰他人浆毫克从步骤 3.2.1 (a) 除以生态囊浆料浓度 (160毫克的仙人掌浆) 来计算微公升微公升虫浆所需的每只小鼠的单个体积每毫升 d5w (e), 并乘以每毫升 1, 000μl, 从毫升转换为微升。 平均每只老鼠 (g) 所需的冰体浆的存量, 方法是将每只小鼠的冰体浆量 (d) 除以小鼠 ( n) 的数量。 通过将平均注入量 (100μl) 除以每只小鼠所需的仙人掌浆的平均库存量 (g) 来计算 cecal 浆料库存 (h) 的平均稀释系数。 计算每只老鼠的特定注入体积, 以微升 (j) 为单位, 方法是将每只老鼠所需的库存 cecal 浆的体积乘以平均稀释系数 (h), 然后将其舍入到最近的十 (以匹配注射注射器的10μl 增量)。 通过从平均注入量 (100μl) 中减去平均冰囊浆料库存 (g), 计算 d5w 的平均所需体积, 以稀释冰囊浆料库存 (k)。 计算微升 (l) 中的仙人掌浆的总量, 方法是将微升 (g) 中每只小鼠的平均生态浆料乘以这个垃圾中的老鼠数量, 再乘以1.4 以产生额外的。 计算稀释冰囊浆料库存所需的 d5w 总量 (m), 将 d5w (k) 的平均所需体积乘以老鼠 (n) 的数量, 乘以1.4 以产生额外的热量。 在计算所需的库存教会浆数量 (l从步骤 3.2.7) 后, 准备好挑战。在 bsc 中, 在室温下解冻所需数量的仙人掌浆瓶, 将其内容物移入混合。 当解冻的仙人掌浆中没有更多可见的冰晶时, 将计算出的仙人掌浆库存量 (l从步骤 3.2.7) 转移到无菌 1.8 ml 微离心管。 通过添加在步骤 3.2.8 (m) 中计算的冰凉 d5w, 稀释到所需的浓度。将挑战的专家存放在冰上。 在装载注射器之前, 将微型离心管混合在一起, 将其闪烁 20x, 然后用 500 cc 28 g 半英寸的胰岛素注射器绘制并排出300-500μl 的 cecal 浆料。 将大约150μl 稀释的仙人掌浆放入同一注射器中。 轻扫注射器, 将气泡从柱塞中取出, 在注射器上稍微向后拉, 然后排出气泡。 将多余的仙人掌浆重新分配回微离心管, 直到在注射器中装载了一个小鼠的正确数量的 cecal 浆, 这是为步骤 3.2.5 (j) 中的单个小鼠计算的。 根据当地相关动物护理机构的指导原则, 或使用下面概述的步骤, 在腹腔内注射盲肠浆料。 在 bsc 中, 将新生鼠与大坝分开, 如步骤3.1 中所述。 用拇指和食指用手指擦洗鼠标的后部。 将鼠标的尾巴固定在中指和无名指的后部, 或在环和小指的前部。 为了最大限度地减少泄漏, 倾斜新生鼠标, 使其朝下, 并插入针斜面对, 在腿和生殖器之间, 保持针浅和皮下。 当针插入1厘米时, 向下和向前按压, 感觉针头刺穿腹膜。慢慢地按压柱塞, 保持针头尖端尽可能稳定, 因为侧向运动可能会损坏老鼠的器官。 小心地取出针头超过 5-10, 沿着相同的路线出出, 放松中指在去除过程中, 以减少在鼠标的身体紧张。 要检查是否有泄漏, 请在取出针头后按住鼠标几秒钟, 以便有时间关闭注射部位, 并观察注射部位的任何泄漏或膨胀情况, 此时不应在分析中使用鼠标。注: 注射部位皮肤破裂表明腹腔内注射失败, 注射是皮下注射。 将鼠标放在纸巾上, 让鼠标迈出一步。如果鼠标不动 5秒, 则轻轻按下尾巴。 取起鼠标, 并检查是否有在注射部位的仙人掌浆泄漏。如果有泄漏, 请将鼠标排除在分析之外, 并对鼠标实施安乐死。 4. 鼠标监控 定期监测老鼠, 检查它们是否到达了一个人道的终点。 观察小鼠2小时后对任何注射相关并发症的挑战。 监测小鼠12小时后对与败血症有关的发病率和在人道终点识别小鼠的情况 (标准见步骤 4.2-4.3)。 随后, 在头2天每4-6 进行一次监测, 但夜间8小时除外, 当时新生老鼠无人看管。 超过2天的后挑战, 每天监控 1x-2 x。如果观察到健康评分下降的病鼠或小鼠, 则将监测频率增加到每4-6。 监测新生小鼠 对于涉及新生鼠的任何手术, 如步骤3.1 所述, 将床上用品转移到新的笼子中 (原因与其中提到的相同)。在护理过程中, 仔细检查从巢穴中拖出来的新生儿。任何在护理过程中被从垃圾中拖出来的老鼠都不应被视为分散的老鼠。 当取出鸟巢顶部时, 识别任何散落的新生鼠要么远离巢穴, 要么卡在筑巢材料中, 但远离垃圾, 但在护理过程中将幼鼠从垃圾中拖走的除外。如果发现鼠标分散, 请参考步骤4.5 中的人道终结点标准。 测量小鼠的正确反应和流动性。 在纸巾上, 将鼠标放在背上, 并监控其在最多4秒内正确的能力。当放置在其背面时, 鼠标将落在左侧或右侧, 这是当4秒计数开始。注: 要被归类为 “权利” 组, 鼠标必须能够得到至少三个四个爪子垫上的纸巾 1 s。它仍然被归类为能够纠正自己, 如果它倒了。 如果鼠标可以自行右转, 则等待8秒以确定其移动级别。 如果鼠标能够纠正自己的权利, 并通过连续多个步骤探索其环境, 则将鼠标归类为 “权利-移动”。 如果鼠标能够纠正自己, 并采取一些步骤来探索它的环境, 则将鼠标归类为 “右-昏昏欲睡”。这一组中的老鼠可能会在走一步的时候摔倒, 站着看起来不稳, 在两步之间停下来。 如果鼠标可以自行移动, 但不会经常移动, 则将鼠标归类为 “rrights-nign”。它可能仍然会掉落, 如果它在8秒内没有采取任何步骤, 它将被归类为 “权利-非移动”。 如果鼠标不能自行纠正, 则根据观察到的臀部运动对其移动性进行分类。注意: 避免重复监视或增加鼠标在背上花费的时间长度, 因为这可能会影响评分系统和人道终结点, 因为如果给更多时间, 在4秒内无法自行对齐的鼠标有时会这样做。 如果鼠标无法自行右转, 并从水平方向显示超过90°角的臀部运动, 则将鼠标归类为 “无法向右 (ftr)-mobile”。一些老鼠如果给出的时间超过 4秒, 可以纠正自己, 但仍应归类为 ftr, 其移动得分基于臀部运动。 如果鼠标无法自行右转, 并从水平方向显示90°以下的臀部运动, 请将鼠标归类为 “ftr-lethargic”。 将鼠标归类为 “ftr-nlo-nob”, 如果它无法纠正自己, 并且有腿可以晃动或振动, 但没有髋关节运动。肢体可以伸展或收缩, 但没有横向运动。老鼠明显生病, 已经达到了人道的终点。 在鼠标另一侧重复步骤 4.3, 记录两侧。注: 有关记录观察结果, 请参阅补充文件。 确定鼠标是否处于人道的终点, 并需要实施表1和下面所示的安乐死。 根据步骤4.3 和4.4 中提到的监测观察, 将鼠标分类到不同的纠正和移动水平。鼠标的移动性是为每一侧测量的, 移动行为被用来确定老鼠是否需要安乐死。 将任何具有 (a) ftr-nutc 或 (b) ftr-lethargic 的右脑的纠正反射分配给与巢穴分离的老鼠, 使其处于人道的终点。 在监测超过20小时的时间点时, 将双方 “不对右” 的纠正反射的任何老鼠分类为处于人道的终点, 因为所提供的数据非常准确地预测, 这些老鼠最终会死于疾病, 而不是恢复。 步骤4.5 中确定的要安乐死的单独小鼠。如果被监视的老鼠不被视为处于人道的终点, 将其放置在没有大坝的新笼子中的第二个空巢中, 并继续与其他新生老鼠在一起。 一旦对整个垃圾进行了监测, 就用大坝将一半的筑巢材料转移到笼子里, 改造一个在中间有新生老鼠空间的鸟巢。注: 不正确形成的巢穴可能会导致老鼠散开, 并减少大坝可以提供的护理量。 把新生老鼠和水坝一起转移回笼子里。 将剩余的筑巢材料放在垃圾上, 轻轻地将其捏在盖子周围, 以确保筑巢材料就位, 从而将垃圾包裹在鸟巢中。 根据当地机构的要求, 对第4.6 步分离的新生小鼠进行安乐死。 5. cecal 浆料的滴定 以所需的挑战剂量挑战小鼠 (第3节) 并监测结果 (第4节)。 观察最终结果是否导致所需的 ld, 如果没有, 重复第3节和第4节与一个新的垃圾在一个更高或更低的挑战剂量, 调整 5%-10%。注: 挑战剂量可能类似于图 1 b,但需要在每个设施和小鼠菌株中进行滴定。 此外, 观察小鼠是否比图 1 b中的预期动力学更快或更慢地达到了人道端点, 并以更高或更低的挑战剂量重复第3节和第4节的新垃圾, 调整 5%-10%。