Baseados em CRISPR-Cas9 genoma engenharia para gerar modelos Jurkat repórter para a infecção de HIV-1 com Sites selecionados Proviral integração
Summary
Nós apresentamos um fluxo de trabalho de engenharia do genoma para a geração de novos modelos in vitro para a infecção de HIV-1 que recapitular integração proviral em locais seleccionados genômicas. Segmentação dos repórteres HIV-derivado é facilitada pela manipulação de genoma CRISPR-Cas9-mediada, site-specific. Protocolos detalhados para geração de clone de célula única, triagem e verificação de direcionamento correta são fornecidos.
Abstract
Vírus de imunodeficiência humana (HIV) integra o DNA proviral não aleatoriamente no genoma da célula de acolhimento em sites recorrentes e genômicas hotspots. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a geração de novos modelos in vitro para a infecção pelo HIV com sites de integração genômica escolhido usando tecnologia de engenharia baseados em CRISPR-Cas9 genoma. Com este método, uma sequência de repórter de escolha pode ser integrada em um locus genômico escolhido, alvo, refletindo sites integração clinicamente relevantes.
No protocolo, o design de um repórter de HIV-derivado e escolhendo de uma sequência de site e gRNA de destino são descritos. Um vetor de direcionamento com braços de homologia é construído e transfectado em células Jurkat T. A sequência de repórter é direcionada para o site selecionado genômico por recombinação homóloga, facilitada por uma quebra de dobro-costa Cas9-mediada no local de destino. Clones de célula única são gerados e examinados para segmentação de eventos por citometria de fluxo e PCR. Os clones selecionados são então expandidos, e direcionamento correto é verificado pela PCR, sequenciamento e mancha do Sul. Eventos fora do alvo potencial de engenharia CRISPR-Cas9-mediada do genoma são analisados.
Usando este protocolo, sistemas de cultura de células de novela essa infecção de HIV modelo em sites de integração clinicamente relevantes pode ser gerada. Embora a geração de clones de célula única e verificação de integração de sequência correto repórter são demorados, as linhas clonais resultantes são ferramentas poderosas para analisar funcionalmente a escolha do local de integração proviral.
Introduction
Integração do DNA proviral no genoma hospedeiro após infecção é um passo crítico no ciclo de vida do vírus de imunodeficiência humana (HIV). Após a integração, o HIV persiste, estabelecendo a latência em subconjuntos de células T CD4 + long-lived tais como as células T CD4 + de memória. Integração do HIV parece ser não-aleatória1,2. Um número de hotspots genômicas com DNA proviral recorrentemente integrado foi detectado em vários estudos através do sequenciamento de sites de integração em indivíduos infectados agudamente e cronicamente2,3,4 ,5,6,7,8. Curiosamente, em alguns destes sites de integração, o mesmo locus foi detectado em uma grande fração de células infectadas, levando à ideia de que integração em locais recorrentes pode afetar positivamente a expansão clonal1.
Para avançar a nossa compreensão da importância de sites de integração recorrentes, escolha de local de integração proviral deve ser explorada. No entanto, vários aspectos técnicos dificultam a integração de HIV estuda site escolha e as consequências. Amplamente utilizados modelos de cultura celular de latência do HIV, como linhas de célula JLat não refletem integração recorrentes clinicamente relevantes sites9. Estudos em células derivado de paciente primários, por um lado, permitem a descrição da paisagem local de integração de sequenciação mas não permitem análises funcionais. A nosso conhecimento, nenhum modelo experimental adequado está disponível para analisar funcionalmente sites selecionados de integração clinicamente relevantes.
Aqui nós apresentamos um fluxo de trabalho detalhado para gerar novos modelos para a infecção pelo HIV, utilizando tecnologia de engenharia baseados em CRISPR-Cas9 genoma. O fluxo de trabalho aqui descrito pode ser usado para gerar linhas de células de repórter derivado de células T que modelam a infecção pelo HIV, carregando um repórter proviral integrado genomically em um site de integração escolhido. Assim, estão servindo como novas ferramentas para explorar como o site de integração proviral pode afetar a biologia do HIV, e como o pró-vírus responde às estratégias de tratamento diferentes (por exemplo,, inducibility por agentes de inversão de latência). Nosso método usa as vantagens de engenharia baseados em CRISPR-Cas9 genoma, no qual a integração do repórter sequência por recombinação homóloga é facilitada por uma quebra Cas9 induzida por nuclease dobro-costa no local de destino. Sites de destino para a integração são escolhidos de acordo com a proximidade aos locais descritos integração recorrentes de estudos em indivíduos infectados pelo HIV e a presença de motivos de PAM apropriados para engenharia de genoma Cas9-mediada.
Em nossos resultados exemplares, enfocamos o locus de gene BACH2, quais códigos para o regulador transcricional BTB e homologia de CNC 2. Em indivíduos cronicamente infectadas com o HIV em terapia anti-retroviral, BACH2 é um dos loci mostrando o enriquecimento de integrado HIV-1 sequências3,6,7,8,10. Nós escolhemos um repórter HIV-derivado mínimo consistindo de HIV-1-derivado longo terminal repetição (LTR), a sequência de código tdTomato e hormônio de crescimento bovino (BGH) sinal de poliadenilação (PA), que podemos ter como alvo a dois locais específicos em BACH2 intron 5. O protocolo apresentado é otimizado para células Jurkat, uma humana CD4 + linha celular suspensão derivado de células T, mas outras células linhas podem ser utilizadas e o protocolo adaptado em conformidade. Apresentamos um fluxo de trabalho detalhado para a seleção do local de destino, a construção do vetor de alvo com braços de homologia, CRISPR Cas9-mediada por direcionamento do repórter no local escolhido genômico, geração e seleção de linhas clonais e abrangentes verificação linha de celular do repórter recém-gerado, alvo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo para gerar modelos de HIV-1-derivado Jurkat repórter com sites de integração proviral escolhido aplicando engenharia CRISPR-Cas9-baseado do genoma.
Vários pontos do protocolo requerem atenção cuidadosa durante a fase de planejamento. Primeiro, o locus ser alvo deve ser escolhido com cuidado, como alguns loci pode ser mais fácil para o alvo do que outros (por exemplo,, dependendo do estado da cromatina da região e o destino de sequências em si). …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Britta Weseloh e Bettina Abel para assistência técnica. Agradecemos também Arne Düsedau e Jana Hennesen (fluxo cytometry plataforma tecnológica, Heinrich Pette Institut) para suporte técnico.
Materials
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
| pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
| NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
| TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
| 96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
| Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
| QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
| RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
| L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
| Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
| Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
| Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
| Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
| High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
| illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |
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