選択したプロウイルス統合サイトの HIV-1 感染の Jurkat レポーターのモデルを生成する CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学
Summary
プロウイルス選択したゲノム サイト統合を要約 HIV-1 感染の新しい体外モデルの生成のゲノム工学ワークフローを提案します。記者の HIV 由来のターゲットは、CRISPR Cas9 媒介、サイト固有のゲノム操作によって促進されます。単一細胞クローン生成、スクリーニング、および正しいターゲットの検証のための詳しいプロトコルを提供しています。
Abstract
ひと免疫不全ウイルス (HIV) は、再発のサイトやゲノムのホット スポットでホスト細胞のゲノムに非ランダムにプロウイルス DNA を統合します。ここで CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学技術を使用して選ばれたゲノム統合サイトと HIV 感染の新規の in vitro モデルの生成の詳細なプロトコルを紹介します。この方法では、選択の記者のシーケンスに統合できます、選択したターゲットを絞った genomic 位置臨床的に関連する統合サイトを反映しています。
プロトコルでは、HIV 由来の記者の設計およびターゲット サイトと gRNA シーケンスの選択を説明します。両手を相同性ターゲット ベクトルが構築され、Jurkat T 細胞にトランスフェクションします。ターゲット ・ サイトで Cas9 を介した二重鎖切断によって促進される相同組み換えによる記者シーケンスは選択したゲノム サイト向けです。単一細胞のクローンを生成およびフローサイトメトリー PCR によって対象化、イベント上映します。選択されたクローンが展開し、PCR、シーケンシング、および南にしみが付くことによって検証は正しいターゲットします。CRISPR Cas9 を介したゲノム工学の潜在的なターゲットを離れてイベントが分析されます。
このプロトコルは、新しい細胞培養システムを用いた臨床的に関連する統合サイトでそのモデルの HIV 感染を生成できます。正しい記者シーケンス統合の単一細胞クローンの生成と検証は時間がかかるが、結果として得られる系統、機能的プロウイルス統合サイトの選択を分析するための強力なツールです。
Introduction
感染宿主ゲノムにプロウイルス DNA の統合は、ひと免疫不全ウイルス (HIV) のライフ サイクルの重要なステップです。次の統合、HIV はメモリー cd4 陽性 T 細胞など寿命の長い cd 4 + T 細胞のサブセットの遅延を確立することによって永続化します。HIV の統合は、非ランダムな1,2に表示されます。急性と慢性感染した人2,3,4 の統合サイトのシーケンスを通していくつかの研究で反復的統合のプロウイルス DNA ゲノム ホット スポットの数が検出されました、5,6,7,8。興味深いことに、これらの統合サイトのいくつかで同じ軌跡がリカレント サイトの統合も積極的にクローン性増殖1に影響を与える可能性があります考えにつながる、感染細胞の大部分で検出されました。
再発統合サイトの意義の理解を進めるためプロウイルス統合サイトの選択肢を検討する必要があります。ただし、いくつかの技術的な側面を妨げる勉強 HIV 統合サイトの選択と結果。JLat 細胞株は臨床的再発統合サイト9を反映していないような広く HIV 待ち時間の細胞モデルを使用しました。プライマリ患者由来細胞の研究、一方で、配列による統合サイト風景の説明を有効にするが、機能解析を可能にしません。我々 の知識に十分な実験モデルは機能的選択した臨床的に関連する統合サイトを分析する利用可能なありません。
CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学技術を使用して HIV 感染のための新しいモデルを生成するための詳細なワークフローをご紹介します。ここ記載されているワークフローは、モデル選択した統合サイトで genomically 統合プロウイルス記者を運ぶ HIV 感染 T 細胞由来のレポーター細胞ラインを生成する使用できます。彼らしたがってプロウイルス統合サイトによる hiv 感染生物学への影響し、provirus が別の治療戦略 (待機時間逆転エージェントによる,誘導など) に応答する方法を探索する新しいツールとして提供しています。本手法は、CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学、ターゲット ・ サイトで、Cas9 ヌクレアーゼ誘起の二重鎖切断によって促進される相同組み換えによるシーケンス レポーターの統合の利点を使用します。ターゲット ・ サイトの統合には、HIV 感染者と Cas9 を介したゲノム工学のための適したの PAM モチーフの存在に関する研究から説明再発統合サイトへの近さによって判断されます。
模範的な結果、BTB および CNC の相同性転写レギュレータ 2 のコード BACH2 遺伝子座に注力します。抗レトロ ウイルス療法に慢性的な HIV 感染、個人で BACH2 は統合された HIV-1 シーケンス3,6,7,8,10の濃縮を示す遺伝子座であります。BACH2 イントロン 5 の 2 つの特定のサイトにしようと思いましたが HIV 由来 1 長いターミナル リピート (左から右)、tdTomato コーディング シーケンスとウシ成長ホルモン (BGH) 起こる信号 (PA) から成る最小 HIV 由来の記者をしました。提案するプロトコルは、Jurkat 細胞、ヒト cd4 T 細胞由来の懸濁液セル行が線を使用して他のセルおよびそれに応じて適応プロトコルに最適です。相同性の腕、CRISPR-Cas9-介したレポーターのターゲットに選ばれたゲノム サイト、世代クローン系統の選抜に、包括的な目標点のベクターの構築対象サイトの選択の詳細なワークフローを提案する検証新しく生成された、対象となるレポーター細胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、選ばれたプロウイルス統合サイト CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学の応用と HIV 由来 1 Jurkat 記者のモデルを生成するプロトコルについて述べる。
プロトコルのいくつかのポイントでは、計画段階で細心の注意が必要です。いくつかの遺伝子座は他の人よりもターゲットに簡単かもしれませんので対象となる軌跡を注意深く選択する必要があります最初に、(例,</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
テクニカル サポート、ブリッタ Weseloh とベッティーナのアベルに感謝します。我々 もありがとうアルネ Düsedau、Jana Hennesen (流れ cytometry 技術プラットフォーム ハインリッヒ Pette Institut) テクニカル サポート。
Materials
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
| pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
| NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
| TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
| 96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
| Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
| QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
| RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
| L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
| Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
| Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
| Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
| Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
| High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
| illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |
References
- Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
- Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells. Nature Communications. 8 (1), 498 (2017).
- Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection. Cell. 160 (3), 420-432 (2015).
- Han, Y., Lassen, K., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
- Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).
- Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection. Science. 345 (6196), 570-573 (2014).
- Maldarelli, F., Wu, X., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro. The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).
- Mack, K. D., Jin, X., et al. HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).
- Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).
- CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf (2013)
- Gibson Assembly Protocol. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/ (2009)
- Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/ (2014)
- Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website Available from: https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ (2013)
- Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool. Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).
- Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection. Virus Research. 249, (2018).
- Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems. PloS ONE. 11 (6), e0158294 (2016).
- Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity. Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).
- Jensen, K. T., Fløe, L., et al. Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency. FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).
- Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).
- Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. Position effects influence HIV latency reversal. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).
