Basati su CRISPR-Cas9 genoma ingegneria per generare modelli di Jurkat Reporter per infezione da HIV-1 con integrazione Proviral selezionati siti
Summary
Vi presentiamo un flusso di lavoro ingegneria di genoma per la generazione di nuovi modelli in vitro per infezione da HIV-1 che ricapitolano integrazione proviral a selezionati siti genomici. Targeting dei reporter HIV-derivato è facilitato dalla manipolazione del genoma CRISPR-Cas9-mediata, site-specific. Sono disponibili protocolli dettagliati per cella singola clone generazione, lo screening e la corretta verifica targeting.
Abstract
Virus di immunodeficenza umana (HIV) integra il DNA provirale non casualmente nel genoma della cellula ospite alle ricorrenti siti e genomico hotspot. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione di nuovi modelli in vitro per l’infezione da HIV con siti di integrazione genomica selezionate utilizzando la tecnologia di ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma. Con questo metodo, una sequenza di reporter di scelta può essere integrata in un locus genomico mirato, selezionato, riflettendo siti di integrazione clinicamente rilevanti.
Nel protocollo, la progettazione di un reporter di HIV-derivato e scegliendo di una sequenza di destinazione sito e gRNA sono descritti. Un vettore targeting con braccia di omologia è costruito e transfected nelle cellule di T di Jurkat. La sequenza di reporter si rivolge al sito genomico selezionato tramite la ricombinazione omologa, facilitata da una pausa di doppio filo Cas9-mediata al sito di destinazione. Cloni unicellulari sono generati e proiettati per ottimizzazione degli eventi mediante citometria a flusso e PCR. Cloni selezionati vengono quindi espansi e targeting corretta viene verificato mediante PCR, sequenziamento e macchiare del sud. Vengono analizzati potenziali eventi fuori bersaglio di ingegneria CRISPR-Cas9-mediata del genoma.
Utilizzando questo protocollo, sistemi di coltura cellulare romanzo può essere generato l’infezione da HIV tale modello presso siti di integrazione clinicamente rilevanti. Anche se la generazione di cloni unicellulari e verifica dell’integrazione sequenza corretta reporter è lunghe, le linee clonali risultante sono potenti strumenti per analizzare in modo funzionale scelta del sito di integrazione proviral.
Introduction
Integrazione del DNA provirale nel genoma ospite al momento dell’infezione è un passo fondamentale nel ciclo di vita del virus di immunodeficenza umana (HIV). A seguito di integrazione, l’HIV persiste attraverso la definizione di latenza in sottoinsiemi di cellule T CD4 + longevi come cellule T CD4 + di memoria. Integrazione di HIV sembra essere non casuale1,2. Un numero di hotspot genomico con DNA provirale ricorrentemente integrato è stato rilevato in parecchi studi attraverso il sequenziamento dei siti di integrazione in individui acutamente e cronicamente infettati2,3,4 ,5,6,7,8. È interessante notare che, in alcuni di questi siti di integrazione, stesso locus è stato rilevato in una grande frazione delle cellule infettate, che conduce all’idea che integrazione alle ricorrenti siti potrebbe influenzare positivamente l’espansione clonale1.
Per avanzare la nostra comprensione del significato dei siti di integrazione ricorrenti, scelta del sito di integrazione proviral deve essere esplorata. Tuttavia, diversi aspetti tecnici ostacolano lo studio integrazione HIV sito scelta e le conseguenze. Ampiamente utilizzati modelli di coltura cellulare per latenza di HIV come linee cellulari JLat non riflettono clinicamente rilevante integrazione ricorrenti siti9. Studi su cellule primarie derivate dal paziente, da un lato, attivare la descrizione di integrazione sito paesaggio dall’ordinamento ma non consentono analisi funzionali. A nostra conoscenza, nessun modello sperimentale adeguato è disponibile per analizzare i siti selezionati clinicamente rilevante integrazione funzionalmente.
Qui presentiamo un flusso di lavoro dettagliato per generare nuovi modelli per l’infezione da HIV usando tecnologia di ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma. Il flusso di lavoro descritto nel presente documento può essere utilizzato per generare linee cellulari derivati da cellule T reporter che modellano l’infezione da HIV, che trasportano un reporter proviral genomicamente integrato in un sito di integrazione selezionate. Servono così come nuovi strumenti per esplorare come il sito di integrazione proviral può influenzare la biologia di HIV e come provirus risponde a diverse strategie terapeutiche (ad esempio, 270ms dagli agenti inversione di latenza). Il nostro metodo utilizza i vantaggi dell’ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma, in quale integrazione del reporter sequenza di ricombinazione omologa è facilitato da una pausa di doppio filo indotta da nucleasi Cas9 al sito di destinazione. Siti di destinazione per l’integrazione sono scelti secondo la vicinanza ai siti integrazione ricorrente descritto da studi su individui affetti da HIV e la presenza di motivi di PAM adatti per ingegneria Cas9-mediata del genoma.
Nei nostri risultati di esemplare, ci siamo concentrati sul luogo del gene BACH2, che codifica per il regolatore trascrizionale di BTB e CNC omologia 2. In individui HIV-infettati cronicamente sulla terapia antiretrovirale, BACH2 è uno dei loci risultati arricchimento di HIV-1 integrato sequenze3,6,7,8,10. Abbiamo scelto un reporter HIV-derivato minimo costituito da HIV-1-derivati lungo terminale di ripetizione (LTR), sequenza di codificazione di tdTomato e ormone della crescita bovina (BGH) segnale di poliadenilazione (PA), che siamo presi di mira a due siti specifici in BACH2 introne 5. Il protocollo presentato è ottimizzato per Jurkat cellule, un’umano CD4 + linea cellulare T cellula-derivati sospensione, ma altri cell le linee possono essere utilizzate e il protocollo adattato di conseguenza. Vi presentiamo un flusso di lavoro dettagliato per la selezione del sito di destinazione, costruzione del vettore di destinazione con le braccia di omologia, CRISPR-Cas9-mediata di targeting del reporter nel sito genomico scelto, la generazione e la selezione di linee clonali e complete verifica delle varietà di cellula di reporter appena generato, mirati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un protocollo per generare modelli di HIV-1-derivati Jurkat reporter con siti di integrazione proviral selezionate l’applicazione di ingegneria basati su CRISPR-Cas9 genoma.
Alcuni punti del protocollo richiedono attenzione durante la fase di pianificazione. In primo luogo, il luogo di destinazione dovrebbe essere scelto con attenzione, come alcuni loci potrebbero essere più facile bersaglio di altri (ad es., a seconda dello stato della cromatina della regione e la d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Britta Weseloh e Bettina Abel per assistenza tecnica. Ringraziamo anche Arne Düsedau e Jana Hennesen (piattaforma tecnologica flusso cytometry, Heinrich Pette Institut) per il supporto tecnico.
Materials
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | vector for expression of SpCas9 and gRNA |
| pMK | GeneArt | mammalian expression vector for cloning | |
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | mammalian expression vector for cloning |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | restriction enzyme |
| NEBuilder Hifi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Assembly cloning kit used for target vector generation |
| TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA polymerase with proofreading activity used for amplification of homology arms (step 1.2.2.2), verification of integration site and reporter sequence (step 3.3.3 and 3.3.5), generation of genomic probe for Southern blot (step 3.4.1.5) and analysis of off-target events (step 3.5.4) |
| 96-well tissue culture plate (round-bottom) | TPP | 92097 | tissue culture plates for dilution plating |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 L | DNA polymerase used for detection of targeting events (step 2.4.2) and generation ofreporter-specific probe for Southern blot (step 3.4.1.4) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D9170 | dimethyl sulfoxide as PCR additive |
| Magnesium Chloride (MgCl2) Solution | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 solution as PCR additive |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | dNTP mixture with 10 mM of each nt for PCR reactions |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | ready-to-use PCR mix used for screening PCR (step 3.2.11) |
| QIAamp DNA blood mini kit | Qiagen | 51106 | DNA isolation and purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | PCR Purification Kit |
| RPMI 1640 without glutamine | Lonza | BE12-167F | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum South Africa Charge | PAN Biotech | P123002 | cell culture medium supplement |
| L-glutamine | Biochrom | K 0282 | cell culture medium supplement |
| Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml / 10.000 µg/ml | Biochrom | A 2212 | cell culture medium supplement |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | cell culture medium with reduced serum concentration optimized for transfection |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | transfection reagent |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | cell culture reagent |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | cell culture reagent |
| Syringe-driven filter unit, PES membrane, 0,22 µm | Millex | SLGP033RB | filter unit for sterile filtration |
| Heracell 150i incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | tissue culture incubator |
| Amershan Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN1520B | positively charged nylon membrane for DNA and RNA blotting |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
| High Prime | Roche | 11585592001 | kit for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers |
| illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | chromatography spin-columns for purification of labeled DNA |
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