在体外陶氏蛋白聚集与药物筛选研究方法

1. 试剂制备 反应缓冲器 准备反应缓冲液: 0.5 mm tcep 在 pbs 中, ph 6.7 通过溶解 tcep 干粉 (mM = 286.65 g/mol) 在 pbsstock 溶液中, ph 7.4。注: tcep 的存在是由于桥接聚集研究使用野生类型的 tau 蛋白, 其中包含半胱氨酸。在目前的协议中, tcep 仅用于将 pbs 的 ph 值从7.4 调整到 6.7, 在调节任何氧化还原反应方面没有任何作用。 通过0.22μm 孔径 pes 膜过滤器彻底混合并过滤溶液。 在-80°c 时进行液体储存。 使用前在长凳上解冻并稳定在 rt。 胡陶441 删除 hutau441 (用于蛋白质表达和纯化, 请参见 apetri等人.24) 从-80°c 冰柜。 在长凳上解冻, 并平衡到室温 (rt)。 在20-25 的 12, 000 x 克的情况下, 用蛋白质库存旋转管 5分钟, 以消除气泡。 使用 0.31 ml mg-1 厘米-1 厘米-1 的消光系数, 在280纳米的情况下通过吸收测量 hutau441 的浓度 硫代黄素 t 在35毫升反应缓冲液中溶解10毫克的 tht 干粉 (mwtectxice18.3886 g/mol), 制备500μm 硫代黄素 t (t) 库存溶液。 以最大速度彻底混合, 旋涡 3次, 持续 20秒, 并通过0.22μm 孔径 pes 膜过滤器过滤溶液。 使用 22, 000 m-1 cm-1 的消光系数在411纳米处通过吸收测量确定浓度, 并将 tht 浓度调整为500μm。存储在 rt 保护免受光线的影响。每2个月准备一次新鲜的。 肝 素 在 rt 1 毫升反应缓冲液中溶解1毫克 hmw 肝素干粉 (mL = 17-19 kda), 制备新鲜的55μm 肝素溶液。 用力摇晃, 涡旋 2次, 持续5秒。 过滤溶液通过一个不育0.20μm 孔径 pes 膜过滤器 (注射器)。 2. 多模微板读卡器上的连续模式 tht 聚合检测 注: 在反应中添加了 tht 染料, 以连续模式 (自动测量) 监测 hutau441 聚集动力学。虽然反应之后可以使用常规的 cuvette 进行常规荧光计, 但操作的手动性质限制了测量频率, 并损害了记录的动力学曲线的准确性。因此, 使用了自动多模微板读取器。 仪器设置 打开计算机和多模式微板读取器。让设备稳定10分钟。 启动软件并准备协议。 选择协议类型: 标准协议 (每个板块独立执行数据缩减)。 将温度设置为 37°c, 并在继续使用协议之前选择预处理。 设置动能运行: 运行时间 50小时/测量间隔: 15分钟。 在连续模式下将轨道晃动设置为 425 cpm (3 毫米)。 选择读取方法: 荧光强度-内点-动力学-单色仪波长: 励磁440纳米 (20 纳米带宽)/发射 485 nm (20 纳米带宽)-光学位置: 顶部-正常读取速度-读取高度: 4.50 mm 使用创建的协议启动运行。命名实验, 选择新创建的文件的目标, 并允许仪器预先平衡到所需的温度。 自发 hutau441 转换 在 1.5 ml 管中制备反应样品。每个反应使用200μl 混合和至少4个重复 (4个复制物的反应体积 = 800μl)。 制备含有 15μm hutau441、8μm 肝素和50μm 肝素的800μl 反应样品 (在4个重复的情况下), 首先将蛋白质与反应缓冲液混合, 加入肝素和 tht, 然后向上和向下向上和向下移液5次。遵守指定的试剂添加顺序。 在 12, 000 x g 和25°c 下旋转样品 5分钟, 以消除气泡。 在96孔微板 (96 孔黑色固体微板, 井体积 360μl, 平底) 中, 每口井分配200μl 反应样品。避免气泡的形成。 密封微板, 避免蒸发。 将微板放置在多模微板读取器中, 并开始测量。 实验完成后, 从设备中取出板材, 并将数据导出到数据处理软件中。 产品转化、种子收集和储存的质量检查。 从板材上取下封口机, 并将不同的重复物集中在 1.5 ml 管中。在收集样品之前, 通过向上和向下两次移液, 将汇总后的样品很好地混合在井中。总的总量往往会沉积在井底。 通过向上和向下5次移液, 在 1.5 ml 管中彻底混合, 并在云母表面分配 10-20μl, 以便通过 afm 分析聚集体 (详情见 apetri等.24). 在 20, 000 x g 和4°c 下纺 1, 000 x g 和 4°c 1小时, 收获集料。集料形成一个颗粒。 用 s-mals 分离和分析上清液, 以确认样品中没有单体 tau, 表明成功转换为聚合物 (详情见 apetri等人).24). 标记含有剩余集料 (颗粒) 的 1.5 ml 管, 表明最初的 hutau441 蛋白浓度和样品体积。捕捉冻结集料, 并将其存放在-80°c。 所需的反应 从-80°c 冷冻机中取出 hutau441 集料。加入标签上标明的反应缓冲量 (初始样品体积), 让管材稳定到 rt, 通过移液5到8次重新将聚合物重新移出5至8倍。 对汇总样本进行分类。对于200μl 样品 (15μm hutau441), 使用半英寸微尖端 (从100μl 到 10 ml) 在冰上超声, 总共有15秒的时间, 使用的脉冲为 1秒, 振幅为30%–为 2秒 (声纳器250瓦)。将样品重新平衡到 rt。注: 使用的超声条件导致相同的卷纤维种群, 长度为20-50 纳米24。 在 1.5 ml 管中制备反应样品。每个反应使用200μl 混合和至少4个重复 (4个复制物的反应体积 = 800μl)。 制备含有 15μm hutau441、8μm 肝素和50μm 肝素的800μl 反应样品, 首先将蛋白质与反应缓冲液混合, 加入肝素和 tht, 通过向上和向下移液5次进行良好的混合。遵守指定的试剂添加顺序。 在 12, 000 x g 和25°c 下旋转样品 5分钟, 以消除气泡。 在96井 (96 孔黑色固体微板, 井体积 360μl, 平底) 中, 每口井分配200μl 反应样品。避免气泡的形成。 通过重复向上和向下移液 (5次) 彻底同质化预成型的纤维样品, 并将相应的种子百分比添加到每口井中。对于200μl 井总体积, 2μl 的预成型种子添加为 1% (v/v)。在井中加入时, 通过向上和向下三次进行移液混合, 避免形成气泡。 密封微板, 避免蒸发。 将微板放置在多模微板读取器中, 并开始测量。 从设备中取出板, 并将数据导出到电子表格中。