Inductie en evaluatie van inteelt kruisen met behulp van de mier, Vollenhovia Emeryi
Summary
In dit protocol, worden methoden voor het uitvoeren van inteelt kruisen, en voor de beoordeling van het succes van deze kruisen, beschreven voor de mier Vollenhovia emeryi. Deze protocollen zijn belangrijk voor experimenten gericht op het begrijpen van de genetische basis van geslacht bepaling systemen in de Hymenoptera (Vliesvleugeligen).
Abstract
De genetische en moleculaire componenten van de seks-bepaling cascade zijn uitvoerig bestudeerd in de honingbij, Apis mellifera, een Hymenoptere model-organisme. Echter, er is weinig bekend over de mechanismen van de seks-bepaling gevonden in andere niet-model Hymenoptere taxa, zoals mieren. Vanwege de complexe aard van de levenscyclus die geëvolueerd in de Hymenoptere soorten, is het moeilijk te handhaven en uit te voeren experimentele kruisingen tussen deze organismen in het laboratorium. Hier beschrijven we de methoden voor het uitvoeren van inteelt kruisen en voor de beoordeling van het succes van deze kruisen in mier Vollenhovia emeryi. Inducerende inteelt in het laboratorium met V. emeryi, is relatief eenvoudig vanwege de unieke biologie van de soort. Specifiek, deze soort produceert alopecia mannetjes en vrouwelijke reproductives vertonen vleugel polymorfisme, waardoor eenvoudiger identificatie van de fenotypen in genetische kruisen. Bovendien, is evaluatie van het succes van inteelt eenvoudig zoals mannetjes kunnen continu worden geproduceerd door inteelt kruisen, terwijl normale mannen alleen tijdens een welomschreven reproductieve seizoen in het veld weergegeven. Ons protocol toestaan voor het gebruik van V. emeryi als een model om te onderzoeken van de genetische en moleculaire basis van het geslacht bepaling systeem in mier soorten.
Introduction
Hymenoptere eusociale taxa, zoals mieren en bijen, geëvolueerd in een systeem van haplodiploid seks-bepaling in welke personen die heterozygoot op één of meer aanvullende seks vastberadenheid zijn loci (CSD) geworden vrouwtjes, terwijl degenen die homo- of hemizygous mannetjes (Figuur 1A)1geworden.
Genetische en moleculaire componenten die betrokken zijn bij het geslacht bepaling trapsgewijs zijn goed bestudeerd in de honingbij, Apis mellifera, een Hymenoptere model organisme2,3,4. Recente vergelijkende genomica-onderzoek suggereren dat de mieren en honingbijen vele putatief homologen in het geslacht bepaling traject, zoals het eerste geslacht bepaling gen, csd5delen. Bewijs voor de functionele instandhouding van deze homologen ontbreekt echter nog steeds in de mieren.
Om aan te pakken dit probleem, inteelt lijnen moeten worden ontwikkeld, zoals ze essentieel voor genetische kartering en moleculaire studies zijn. Het is echter moeilijk te handhaven en uit te voeren experimentele kruisingen tussen deze organismen in het laboratorium vanwege de complexe aard van de levenscyclus die geëvolueerd zijn.
Hier, gebruiken wij Vollenhovia emeryi als een model om te onderzoeken van de genetische en moleculaire basis van het geslacht bepaling systeem in mieren6,7. De inteelt lijnen van deze soorten zijn eerder ontwikkeld voor koppeling toewijzing van kwantitatieve trait loci (QTL) voor traits gerelateerde geslacht bepaling voor de eerste keer in mieren6. Daarnaast is de moleculaire seks-bepaling cascade onderzochte7geweest. Deze soort heeft zich ontwikkeld van een ongewone reproductiesysteem die gebruikmaakt van zowel de gynogenesis als de androgenesis (Figuur 1B)8,9. De meeste nieuwe koninginnen en mannetjes klonaal geproduceerd van de moeders en vaders genomen, respectievelijk. Bovendien, werknemers en sommige koninginnen seksueel worden geproduceerd8. Deze reproductiesysteem is bijzonder goed geschikt voor genetische studies omdat de inteelt kruisen geproduceerd met behulp van seksueel geproduceerd koninginnen en mannetjes genetisch gelijkwaardig is aan een klassieke backcross zijn. Aangezien seksueel geproduceerde queens verschillen morfologisch uit queens geproduceerd van moederlijk genoom10 (Figuur 1B), is uitvoeren en evalueren van inteelt kruisen sterk vereenvoudigd met behulp van deze methode.
In dit artikel, de methoden voor de vaststelling van laboratorium kolonies voor Overstekende test, kruist toepassing van inteelt met behulp van full-sib paren en het evalueren van het succes van deze kruisen met behulp van genotypering van leden van de kolonie en dissectie van mannelijke nakomelingen geslachtsorganen worden beschreven in V. emeryi.
Ongeacht de reproductiesysteem werkzaam, is toepassing van inteelt kruisen vaak de eerste essentiële stap aan een onderzoek naar geslacht bepaling systemen in de Hymenoptera (Vliesvleugeligen). Bijvoorbeeld in Cardiocondyla obscuriortoont het bijna volledig ontbreken van diploïde mannetjes na 10 generaties van full-sib paring in het laboratorium gebrek aan CSD locus11. Het is mogelijk om te voorspellen van het aantal CSD loci van de verhouding tussen mannetjes geproduceerd in inteelt kruisen6,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel demonstreert protocollen die kunnen worden gebruikt voor het opwekken van inteelt kruisen en evalueren van het voorkomen van inteelt in de mier V. emeryi. In de experimenten is genotypering van de individuen gebruikt voor kruisen nodig om ervoor te zorgen dat inteelt kruisen succesvol waren. De effectiviteit van deze kruising tests is echter duidelijk zoals diploïde mannetjes kunnen worden geproduceerd gedurende het hele jaar, terwijl haploïde mannetjes kunnen alleen worden geproduceerd in de herfs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de heer Taku Shimada, de gemachtigde van AntRoom, Tokyo, Japan, voor het verstrekken van ons met zijn foto van V. emeryi reproductives. Dit project werd gefinancierd door de Japan-maatschappij voor de promotie van wetenschap (JSPS) Research Fellowship voor jonge wetenschappers (16J00011) en Grant in steun voor jonge wetenschappers (B)(16K18626).
Materials
| Plaster powder | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Charcoal, Activated, Powder | Wako | 033-02117,037-02115 | |
| Slide glass | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Dry Cricket diet | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Brown shuger | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Styrene Square-Shaped Case | AS ONE | Any size | Size varies by number of ants |
| Incbator | Any brand can be used | ||
| Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B | TAITEC | 0014035-000 | |
| 1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom | WATSON | 131-715CS | |
| Ethanol (99.5) | Wako | 054-07225 | |
| Stereoscopic microscope | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Forseps | DUMONT | 0108-5-PO | |
| Chelex 100 sodium form | SIGMA | 11139-85-8 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TaKaRa | T9181 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| -Cellstain- DAPI solution | Dojindo Molecular Technologies | D523 | |
| VECTASHIELD Hard・Set Mounting Medium with TRITC-Phalloidin | Vector Laboratories | H-1600 | |
| ABI 3100xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8 | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica HyDTM | Leica | Directly contact the constructor formore informations. | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Directly contact the constructor formore informations. |
References
- Mable, B. K., Otto, S. P. The evolution of life cycles with haploid and diploid phases. BioEssays. 20 (6), 453-462 (1998).
- Beye, M., Hasselmann, M., Fondrk, M. K., Page, R. E., Omholt, S. W. The gene csd is the primary signal for sexual development in the honeybee and encodes an SR-type protein. Cell. 114 (4), 419-429 (2003).
- Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454 (7203), 519-522 (2008).
- Nissen, I., Müller, M., Beye, M. The Am-tra2 gene is an essential regulator of female splice regulation at two levels of the sex determination hierarchy of the honeybee. Genetics. 192 (3), 1015-1026 (2012).
- Schmieder, S., Colinet, D., Poirié, M. Tracing back the nascence of a new sex-determination pathway to the ancestor of bees and ants. Nature Communications. 3, 895 (2012).
- Miyakawa, M. O., Mikheyev, A. S. QTL Mapping of Sex Determination Loci Supports an Ancient Pathway in Ants and Honey Bees. PLoS Genetics. 11 (11), (2015).
- Miyakawa, M. O., Tsuchida, K., Miyakawa, H. The doublesex gene integrates multi-locus complementary sex determination signals in the Japanese ant, Vollenhovia emeryi. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 94, 42-49 (2018).
- Ohkawara, K., Nakayama, M., Satoh, A., Trindl, A., Heinze, J. Clonal reproduction and genetic caste differences in a queen-polymorphic ant, Vollenhovia emeryi. Biology letters. 2 (3), 359-363 (2006).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Clonal reproduction by males of the ant Vollenhovia emeryi (Wheeler). Entomological Science. 11 (2), 167-172 (2008).
- Okamoto, M., Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Sexual and asexual reproduction of queens in a myrmicine ant, Vollenhovia emeryi (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecological News. 21, 13-17 (2015).
- Schrempf, A., Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
- De Boer, J. G., Ode, P. J., Rendahl, A. K., Vet, L. E. M., Whitfield, J. B., Heimpel, G. E. Experimental support for Multiple-locus complementary sex determination in the parasitoid Cotesia vestalis. Genetics. 180 (3), 1525-1535 (2008).
- Paladino, L. C., et al. Complementary sex determination in the parasitic wasp Diachasmimorpha longicaudata. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. No gene flow between wing forms and clonal reproduction by males in the long-winged form of the ant Vollenhovia emeryi. Insectes Sociaux. 58 (2), 163-168 (2011).
- Cowan, D. P., Stahlhut, J. K. Functionally reproductive diploid and haploid males in an inbreeding hymenopteran with complementary sex determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (28), 10374-10379 (2004).
- Armitage, S., Boomsma, J., Baer, B. Diploid male production in a leaf-cutting ant. Ecological Entomology. 35 (2), 175-182 (2010).
- Krieger, M. J. B., Ross, K. G., Chang, C. W. Y., Keller, L. Frequency and origin of triploidy in the fire ant Solenopsis invicta. Heredity. 82, 142-150 (1999).
- Seeley, T. D., Mikheyev, A. S. Reproductive decisions by honey bee colonies: Tuning investment in male production in relation to success in energy acquisition. Insectes Sociaux. 50 (2), 134-138 (2003).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. . The Ants. , (1990).
- da Souza, D. J., Marques Ramos Ribeiro, M., Mello, A., Lino-Neto, J., Cotta Dângelo, R. A., Della Lucia, T. M. C. A laboratory observation of nuptial flight and mating behaviour of the parasite ant Acromyrmex ameliae (Hymenoptera: Formicidae). Italian Journal of Zoology. 78 (3), 405-408 (2011).
- Woyke, J. What happens to diploid drone larvae in a honeybee colony. Journal of Apicultural Research. 2 (2), 73-75 (1963).
- Schmidt, A. M., Linksvayer, T. A., Boomsma, J. J., Pedersen, J. S. No benefit in diversity? The effect of genetic variation on survival and disease resistance in a polygynous social insect. Ecological Entomology. 36 (6), 751-759 (2011).
- Schrempf, a., Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
