Transdérmica de medición de la tasa de filtración Glomerular en los ratones

Este manuscrito y el acompañamiento vídeo de entrenamiento proporcionan directrices prácticas para el uso de transdérmica monitores GFR en ratones. Los pasos más críticos en el procedimiento son la correcta fijación del dispositivo en la espalda del animal y bien envolviendo la cinta alrededor del abdomen. La mejor posición es ligeramente izquierda o derecha de la línea media, sobre la caja torácica. El parche y el dispositivo necesitan para fijarse firmemente a la piel, pero no debe ser tan fuerte que restringen la respiración, movimiento, o afectan la circulación de la sangre de la piel debajo del dispositivo, como esto llevaría mediciones defectuosas/inexactas. Además, puesto que el control se produce en ratones conscientes después de que se han recuperado de la anestesia, correcta colocación del dispositivo por parte del cuerpo con menor interferencia de resultados de movimiento en las mediciones de transdérmica con pequeños artefactos de movimiento. Por esta razón, es importante que el dispositivo no esté muy próxima a la parte superior de miembros para que los ratones pueden mover libremente sus hombros.

Es importante depilar los ratones uno o dos días antes de la medición de la TFG, como depilación afecta a la medición de la separación de FITC-sinistrin, con datos preliminares indicando que depilación inmediatamente antes de la medición de transdérmica GFR aumenta la vida media aparente de FITC-sinistrin. Se desconoce el mecanismo para ello. Por lo tanto, para obtener mediciones fiables sobre varios puntos del tiempo y entre experimentos, es recomendable depilarse los ratones con antelación, para permitir que la piel a recuperarse de este proceso antes de proceder con las mediciones de la tasa de filtración glomerular. Crema de depilación no debe aplicarse a la misma área de piel dentro de las 72 h de una solicitud previa, para evitar daño químico a la piel. En muchos casos, el piel re-crecimiento tarda varios días o hasta una semana, y así se puede evitar fácilmente reaplicación de depilación crema dentro de las 72 h.

Porque hasta un 50% de suero creatinina es excretada por sección tubular en ratones¹³, y porque hay mayor reabsorción de urea de los túbulos renales cuando los ratones son deshidratados¹⁴, creatinina sérica y BUN son pobres marcadores de la función renal. Sin embargo, debido a su comodidad, estos ensayos continúan ser utilizado como la principal medida de la función renal en estudios preclínicos de CKD y AKI en ratones. Sin embargo, de acuerdo con la importante contribución de secreción tubular a excreción de creatinina en ratones con normal o cerca de la función renal normal¹³, creatinina del suero demostró poca correlación con la separación de FITC-sinistrin a precios de liquidación alta (baja Vida media FITC-sinistrin), indicando que la creatinina es una medida insensible de la función renal en ratones con lesión renal leve. En contraste, mientras que el bollo se correlaciona bien con la separación de FITC-sinistrin en ratones con insuficiencia renal leve, existe pobre correlación entre BUN y FITC-sinistrin despacho en ratones con lesión renal más severa (alta FITC-sinistrin Half-Life). Esto es probablemente causado por efectos de la reabsorción de urea asociado con deshidratación en animales enfermos con lesión renal grave.

Una ventaja importante de la medición de GFR transdérmica, comparada con cualquier otro despacho de bolo o técnicas de infusión constante para la medición de la TFG, es que no requiere colecciones cuidadosamente cronometrados de sangre u orina. Estos pueden ser particularmente difíciles en ratones ya que tienen volúmenes de sangre total bajo y salida urinaria en comparación con las ratas. Además, ratones necesitan ser manipulados sólo para fijar el dispositivo y la inyección, pero no para venipunctures múltiples, como se requiere para bolo clásico espacio experimentos¹⁵. Además, la duración de la anestesia es corta, y como tal es posible realizar mediciones repetidas en los ratones con el tiempo. La frecuencia en que las mediciones se pueden realizar principalmente depende del estado de salud de los ratones, la aptitud del investigador para inyecciones intravenosas y las regulaciones institucionales locales en las sesiones de anestesia repetida. En ratones sanos, ileso, transdérmica GFR las mediciones pueden realizarse diariamente, con efectos mínimos o no perjudiciales en el ratón. Sin embargo, ratones heridos sufren de AKI o CKD no toleran anestesia repetidas sesiones así como los ratones sanos, y por lo tanto debe reducirse la frecuencia de las mediciones.

La principal limitación de la medida de GFR transdérmica, en comparación con los métodos de separación de bolo para medir la tasa de filtración glomerular en los ratones es que la cinética de excreción se miden sólo como cambio en la intensidad de fluorescencia relativa en el tiempo y no como las concentraciones de indicador absoluto. Debido a esto, sólo es posible medir la constante de la tarifa del decaimiento exponencial solo de la excreción de cinético, que es una estimación muy cercana del GFR normalizado el volumen extracelular¹⁶. Para expresar la tasa de filtración glomerular en mL/min, el volumen extracelular de los animales tiene que ser estimado utilizando un factor de conversión que se estableció en estudios anteriores en que fueron medidas simultáneas de las concentraciones plasmáticas de FITC-sinistrin realizado¹. Sin embargo, este factor de conversión puede no correctamente calcular volúmenes de líquidos extracelulares igualmente bien en todos los ratones, ya que el volumen de líquido puede verse afectado por una variedad de extraños factores incluyendo la edad, sexo, estado de hidratación (que puede ser afectado por quirúrgico intervenciones, así como la lesión renal) y¹⁷. Sin embargo, a diferencia del bolo dosificación método para evaluar la tasa de filtración glomerular en los ratones, medición transcutánea de GFR está sujeta a menos variabilidad operador dependiente ya que no es afectado por errores de dosificación o por errores en la sincronización de colecciones de sangre.

Otra limitación de la técnica de medición transcutánea de GFR es que cambios de señal de línea de base pueden ocurrir durante el transcurso de la medición debido al blanqueamiento de piel fluoróforos y la anestesia necesaria para la inyección de dispositivo accesorio y palpador. Esta limitación fue abordada por Friedemann y sus colegas mediante la implementación de un algoritmo de corrección³. La implementación de este algoritmo condujo a una mejora en la precisión de la técnica transdérmica comparable a una técnica de infusión constante de evaluación de la tasa de filtración glomerular.

Una pregunta más frecuentes es si la pigmentación de la piel en cepas de ratón diferente afecta la transdérmica FITC-sinistrin despacho. Pigmentación de la piel reduce la intensidad de la señal de FITC-sinistrin ya que los pigmentos oscuros absorbe la excitación azul y la verde emisión señales de FITC-sinistrin mediciones. Sin embargo, la tasa de excreción de FITC-sinistrin es independiente de la general intensidad de la señal. Además, mientras que la señal medida es más baja, la señal de fondo también es menor en los ratones pigmentados. Porque la señal de fondo es una mezcla de Autofluorescencia de piel fluoróforos y reflexión de la luz de excitación, hemos encontrado que el cociente de la señal de fondo al máximo es comparable o incluso mejor, en los animales pigmentados. Además, los artefactos de movimiento, que son causadas por la exposición de la piel circundante a luz reflejada, se reduce en ratones pigmentados ya que la luz reflejada también se absorbe por piel pigmentada.

En conclusión, la técnica que hemos presentado permite la medida exacta de GFR en consciente, libremente mover ratones de todo tipo de piel. Como la técnica es independiente de la muestra de sangre, puede ser utilizado varias veces en el mismo animal para observaciones longitudinales en modelos de ERC, así como para la medición de los rápidos cambios de la tasa de filtración glomerular que ocurre después de la inducción de AKI.