Transdermico misurazione del tasso di filtrazione glomerulare in topi

Questo manoscritto e il video di formazione accompagnamento forniscono orientamenti pratici per l’uso di transdermal GFR monitor nei topi. I passaggi più critici nella procedura sono il fissaggio corretto del dispositivo sulla schiena dell’animale e in modo sicuro avvolgere il nastro intorno all’addome. La posizione migliore è leggermente o a sinistra della linea mediana, sopra la gabbia toracica. La patch e il dispositivo devono essere saldamente attaccati alla pelle, ma non dovrebbero essere così stretti che limitare la respirazione, movimento, o influenzare la circolazione sanguigna della pelle sotto il dispositivo, come questo porterebbe a misurazioni difettose/imprecise. Inoltre, poiché il monitoraggio avviene in topi coscienti dopo hanno recuperato dall’anestesia, correggere il posizionamento del dispositivo da parte del corpo con la minima interferenza da risultati di movimento nelle misurazioni transdermico con piccoli artefatti di movimento. Per questo motivo, è importante che il dispositivo non è posizionato troppo vicino alla tomaia delle membra così che i topi possono muoversi liberamente le loro spalle.

È importante depilare i topi uno o due giorni prima della misura di GFR, come depilazione colpisce la misurazione della clearance di FITC-sinistrin, con dati preliminari indicanti che depilazione immediatamente prima della misurazione di transdermal GFR aumenta la emivita apparente di FITC-sinistrin. Il meccanismo per questo è sconosciuto. Pertanto, al fine di ottenere misure affidabili su più punti di tempo e tra esperimenti, si consiglia per depilare i topi in anticipo, per permettere alla pelle di recuperare da questo processo prima di procedere con le misurazioni di GFR. Depilazione crema non deve essere applicata nella stessa area della pelle entro 72 h di un’applicazione preventiva, per evitare danni chimici per la pelle. In molti casi, la ricrescita del pelo prende parecchi giorni o fino a una settimana, e così può essere facilmente evitato riapplicazione della depilazione crema entro 72 h.

Perché fino al 50% di siero creatinina viene escreto dalla sezione tubolare in topi¹³, e perché c’è aumentato riassorbimento di urea da tubuli renali quando i topi sono disidratati¹⁴, creatinina e BUN sono poveri indicatori della funzione renale. Tuttavia, a causa della loro convenienza, queste analisi continuano a essere usato come la principale misura della funzione renale negli studi preclinici di AKI e CKD in topi. Tuttavia, coerentemente con l’importante contributo della secrezione tubulare di escrezione della creatinina nei topi con normale o vicino a, la funzione renale normale¹³, creatinina del siero ha mostrato poca correlazione con FITC-sinistrin liquidazione al prezzo alto spazio (basso Half-Life FITC-sinistrin), che indica che la creatinina è una misura insensibile della funzione renale nei topi con danno renale lieve. Al contrario, mentre BUN correla bene con FITC-sinistrin liquidazione in topi con compromissione renale lieve, c’è scarsa correlazione tra liquidazione BUN e FITC-sinistrin in topi con più grave danno renale (alta FITC-sinistrin Half-Life). Questo è probabilmente causato da effetti di riassorbimento di urea associato a disidratazione in animali malati con insufficienza renale grave.

Dei principali vantaggi della misurazione transcutanea GFR, rispetto a tutti gli altri liquidazione bolo o tecniche di infusione costante per la misura di GFR, è che non richiede accuratamente temporizzate raccolte di sangue o nelle urine. Questi possono essere particolarmente impegnativi in topi che hanno volumi di sangue totale basso e l’uscita urinaria rispetto ai ratti. Inoltre, topi devono essere gestite solo per il fissaggio del dispositivo e iniezione, ma non per più venipunctures, come richiesto per bolo classica liquidazione esperimenti¹⁵. Inoltre, la durata dell’anestesia è breve, e come tale è possibile eseguire misurazioni ripetute in topi individuali nel corso del tempo. La frequenza alla quale le misure possono essere effettuate principalmente dipende lo stato di salute di topi, attitudine del ricercatore per iniezioni endovenose e normative istituzionali locali sulle sessioni di anestesia ripetuta. In topi sani, illesi, misurazioni di GFR transdermico possono essere eseguite giornalmente, con minima o no negativi effetti sul mouse. Tuttavia, feriti topi affetti da AKI o CKD sono improbabili da tollerare l’anestesia ripetute sessioni come pure i topi sani, e così dovrebbe essere ridotto la frequenza delle misurazioni.

La principale limitazione di misura di GFR transdermico, rispetto ai metodi di liquidazione del bolo per misurare il GFR nei topi è che la cinetica di escrezione sono misurati solo come cambiamento di intensità di fluorescenza relativa nel tempo e non come concentrazioni tracciante assoluta. Per questo motivo, è solo possibile misurare la costante di velocità del singolo decadimento esponenziale dell’escrezione cinetico, che è una stima molto vicina del GFR normalizzato su extracellulare del volume¹⁶. Per esprimere GFR in mL/min, volume extracellulare dell’animale deve essere stimata utilizzando un fattore di conversione che è stato stabilito in studi precedenti in cui erano misure simultanee di concentrazioni plasmatiche di FITC-sinistrin eseguito¹. Tuttavia, questo fattore di conversione potrebbe non correttamente stimare volumi fluidi extracellulari ugualmente bene in tutti i topi, poiché il volume del liquido può essere influenzato da una varietà di fattori estranei, tra cui età, sesso, stato di idratazione (che può essere influenzato da chirurgica interventi come pure il danno renale) e¹⁷di peso. Tuttavia, a differenza del bolo metodo per valutare GFR nei topi di dosaggio, misurazione transcutanea di GFR è soggetto minore variabilità dipendente dall’operatore come non è influenzato da errori di dosaggio o da errori nella sincronizzazione delle raccolte di sangue.

Un’altra limitazione della tecnica di misurazione del GFR transcutanea è che turni segnale basale possono verificarsi nel corso della misurazione a causa di sbiancamento della pelle fluorofori e l’anestesia necessaria per dispositivo per iniezione di attaccamento e tracciante. Questa limitazione è stata indirizzata da Friedemann e colleghi mediante l’implementazione di un algoritmo di correzione³. L’implementazione di questo algoritmo ha condotto ad un miglioramento nella precisione della tecnica transdermica paragonabile ad una tecnica di infusione costante di valutazione del GFR.

Una domanda frequente è se la pigmentazione della pelle in diversi ceppi di topi diversi colpisce transdermico FITC-sinistrin liquidazione. La pigmentazione della pelle riduce l’intensità di segnale di FITC-sinistrin poiché pigmenti scuri assorbe l’eccitazione blu e il verde emissione segnali da FITC-sinistrin misure. Tuttavia, il tasso di escrezione di FITC-sinistrin è indipendente nel suo complesso l’intensità del segnale. Inoltre, mentre il segnale misurato è inferiore, il segnale di fondo è anche più basso in topi pigmentati. Poiché il segnale di fondo è una miscela di autofluorescenza di pelle fluorofori e riflessione della luce di eccitazione, abbiamo trovato che il rapporto di fondo-a-massimo segnale è paragonabile, o addirittura migliorate, in animali pigmentati. Inoltre, artefatti di movimento, che sono causati dall’esposizione della pelle circostante a luce riflessa, sono ridotti in topi pigmentati, poiché la luce riflessa è anche assorbita dalla pelle pigmentata.

In conclusione, la tecnica che abbiamo presentato permette la misura precisa della GFR in consapevole, liberi di muoversi topi di tutti i tipi di pelle. Come la tecnica è indipendente del prelievo di sangue, può essere utilizzato ripetutamente sull’animale stesso per osservazioni longitudinali nei modelli CKD, nonché per la misurazione di rapidi cambiamenti della GFR che si verificano dopo induzione di AKI.