小鼠肾小球滤过率的透皮测定
Summary
在这里, 我们描述了一个协议, 以测量肾小球过滤率 (GFR) 在有意识的, 自由移动小鼠使用经皮 GFR 监测。
Abstract
肾小球滤过率 (GFR) 的透皮分析是一种用于评估小鼠肾功能和急性肾损伤和慢性肾脏疾病模型的成熟技术。测量系统包括一个微型荧光探测器, 直接附着在有意识的, 自由移动的动物背部的皮肤上, 并测量外源 GFR 示踪剂, 荧光素-异硫氰酸酯 (FITC) 的排泄动力学。共轭 sinistrin (菊粉模拟)。该系统已在大鼠中详细描述。然而, 由于其体积较小, 对小鼠经皮 GFR 的测量提出了额外的技术挑战。在这篇文章中, 我们提供了第一个详细的实用指南, 使用经皮 GFR 监测仪在小鼠基础上的结合经验, 三个不同的调查人员已经在小鼠进行了这一检测在数年。
Introduction
施莱伯和同事在2012年首次报告了使用经皮 GFR 监测仪, 并通过比较 GFR 的测量结果进行了验证, 通过直接测量 FITC-sinistrin 丸清除序列血液样本1。到目前为止, 已有35个同行评议出版物, 其中经皮 GFR 监测仪已在大鼠和小鼠中使用 (定期更新的期刊文章和会议摘要的清单, 其中使用了临床前 GFR 监测仪, 可在MediBeacon 网站2)。在大鼠和小鼠的透皮 GFR 测量已在一些出版物1,3,4,5和一个视频教程演示它在大鼠的使用已出版6。然而, 小鼠的测量带来了额外的技术挑战。在这里, 我们提供了第一个详细的实用指南, 使用经皮 GFR 监测仪在小鼠。
有多种原因, 调查人员开始倾向于使用经皮 GFR 监测仪评估啮齿类动物模型中的肾脏功能。与传统的肾功能参数如血清肌酐和血尿素氮 (包子) 7 相比, FITC-sinistrin 间隙的透皮检测可提供更灵敏、更准确的肾脏功能测量结果, 8。通过实施改进的评估算法, Friedemann 和同事证明, 该系统达到了与黄金标准相当的精度, GFR 测量的恒定输注技术3。最近的研究也表明, 使用经皮 GFR 监测仪进行顺序分析可用于研究肾功能的早期变化以及诱导急性肾损伤 (空格) 后的功能恢复, 而不会干扰动物的血液。体积或血流动力学, 因为该检测不需要连续血液取样9,10。在同一动物中反复测量高精度和灵敏性 GFR 的能力使得这种技术对各种不同的研究领域具有吸引力。经皮 GFR 监测仪已被制药公司用于评估新化合物的毒性, 以及在大学进行基础和转化研究。
Protocol
Representative Results
Discussion
这份手稿和随附的培训视频为小鼠使用透皮 GFR 显示器提供了实用指南。该过程中最关键的步骤是正确的附件的设备在动物的背部, 并安全地包裹在腹部周围的胶带。最好的位置是稍左或右中线, 在胸腔。该修补程序和设备需要牢固地连接到皮肤, 但他们不应该是如此紧, 他们限制呼吸, 运动, 或影响皮肤血液循环在设备下, 因为这将导致错误/不准确的测量。此外, 由于监测发生在有意识的小鼠后, 他们已经从麻醉中恢复, 正确地放置在身体的一部分, 从运动的干扰最低, 结果在小移动文物的透皮测量。因此, 重要的是, 该设备不太靠近上肢, 使小鼠可以自由移动他们的肩膀。
重要的是在 GFR 测量前脱毛小鼠一到两天, 因为脱毛影响 FITC-sinistrin 间隙的测量, 初步数据表明, 在测量透皮脱毛前立即 GFR 增加FITC-sinistrin 的明显半衰期。这种机制是未知的。因此, 为了在多个时间点和实验之间获得可靠的测量, 建议提前脱毛小鼠, 以便在进行 GFR 测量之前, 允许皮肤从这个过程中恢复。脱毛膏不应适用于同一区域的皮肤在72小时内之前的应用, 以避免化学损坏皮肤。在许多情况下, 毛皮的重新生长需要几天或长达一周的时间, 因此可以很容易地避免在72小时内重新应用脱毛霜。
因为50% 的血清肌酐由小鼠13的管状部分排泄, 并且由于肾小管内尿素的重吸收增加, 当老鼠脱水14时, 血清肌酐和包子是肾功能的不良标志物。然而, 由于其方便性, 这些检测继续被用作小鼠临床前研究中肾功能的主要指标。然而, 与正常或接近正常肾功能的小鼠的管状分泌物肌酐排泄的主要贡献13, 血清肌酐与 FITC-sinistrin 清除率的相关性很小 (低FITC-sinistrin 半衰期), 表明肌酐是对轻度肾损伤小鼠肾功能的一种不敏感的测量方法。与此相反, 在轻度肾功能损害小鼠中, 馒头与 FITC sinistrin 间隙有很好的相关性, 小鼠肾损伤 (高 FITC-sinistrin 半衰期) 与 FITC-sinistrin 间隙有很大关系。这可能是由于尿素重吸收与严重肾脏损伤的患病动物脱水相关的影响所致。
经皮 GFR 测量的一个主要优势, 与所有其他的丸隙或 GFR 测量的恒定输液技术相比, 它不需要仔细定时血液或尿收集。这些在小鼠身上可能特别具有挑战性, 因为它们的总血量和尿量与大鼠相比都低。此外, 小鼠只需要处理附件的设备和注射, 但不能为多个 venipunctures, 根据要求的经典丸清除试验15。此外, 麻醉的持续时间是短的, 因此它是可能的执行重复测量在单个小鼠随着时间的推移。测量的执行频率主要取决于小鼠的健康状况、研究者对静脉注射的能力以及对反复麻醉疗程的当地制度规定。在健康, 未受伤的小鼠, 透皮 GFR 测量可以每天执行, 对鼠标的最小或没有副作用。然而, 患有小鼠或 CKD 的受伤的老鼠不太可能容忍重复的麻醉疗程以及健康的小鼠, 因此测量的频率应该减少。
经皮 GFR 测量的主要局限性, 与小鼠 GFR 的丸清除方法相比, 其排泄动力学只是随着时间的相对荧光强度的变化而不是绝对示踪剂浓度的测定。因此, 仅能测量排泄动力学的单指数衰变的速率常数, 这是对细胞外体积16的 GFR 正常化的非常接近的估计。为了以 mL/分钟表示 GFR, 动物的胞外体积必须使用在先前研究中建立的转化因子进行估计, 其中 FITC-sinistrin 的血浆浓度同时测量1。然而, 这种转化因子可能无法正确估计所有小鼠胞外流体体积, 因为流体体积可能会受到各种外来因素的影响, 包括年龄、性别、水化状态 (可能受手术影响)干预以及肾脏损伤), 重量17。然而, 不同于评估小鼠 GFR 的追加剂量法, 经皮 GFR 测量受操作者依赖性的变化较小, 因为它不受剂量错误或血液收集时间错误的影响。
经皮 GFR 测量技术的另一个局限性是, 由于皮肤荧光染料的漂白和设备附件和示踪剂注射所需的麻醉, 在测量过程中可能会发生基线信号移位。Friedemann 和同事通过实施校正算法3解决了此限制。该算法的实现使经皮技术的精度提高, 与 GFR 的恒定输注技术相媲美。
一个经常被问到的问题是, 不同的小鼠菌株的皮肤色素沉着是否影响透皮 FITC-sinistrin 清除。由于深色颜料吸收蓝色激发和 FITC sinistrin 测量的绿色发射信号, 皮肤色素沉着降低了 FITC sinistrin 信号强度。然而, FITC sinistrin 的排泄率与整体信号强度无关。此外, 在被测信号较低的情况下, 有色小鼠的背景信号也较低。因为背景信号是皮肤荧光基团的自发荧光和激发光的反射的混合物, 我们发现, 在有色动物中, 背景到最大信号比是可比的, 甚至是改进的。此外, 由于反射光也被色素性皮肤吸收, 因此在有色小鼠身上, 由于周围皮肤接触反射光而引起的运动伪影减少。
总之, 我们提供的技术允许在有意识的, 自由移动的所有皮肤类型的小鼠 GFR 的精确测量。由于该技术与血液取样无关, 因此可以在 CKD 模型中反复使用同一动物进行纵向观察, 并可用于测量 GFR 在诱导后发生的快速变化。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了范德比尔特肾脏病中心 (VCKD) 的支持, 部分由以下赠款资助: 国防部 PR161028 和 R01DK112688 (马克 de Caestecker)
我们感谢 MRC、EPSRC 和 BBSRC 资助的英国再生医学平台 “安全和功效, 聚焦成像技术中心” (MR/K026739/1) 对 LS、PM 和 BW 的支持。
Materials
| Transdermal GFR monitor (comes with 1 device, 2 batteries and 1 charger) | MediBeacon GmbH | TDM-MH001 | Reading software: MPD Lab; Analysis software: MPD Studio |
| Additional Batteries | MediBeacon GmBH | PWR-BT0001 | |
| Attachment patches | MediBeacon GmbH | small: PTC-SM001; large: PTC-LG001 | |
| FITC-sinistrin | MediBeacon GmbH | FTC-FS001 | |
| Hypoallergenic silk tape | e.g. Durapore (1538-2), or Kendall (7138C), or Leukosilk (01032-00) | ||
| Anaesthesia chamber, isoflurane, oxygen | |||
| Heat pad | |||
| Electric shaver | |||
| Depilatory (hair removal) cream | e.g. Veet or Nair | ||
| Cotton buds | |||
| Cotton swabs | |||
| Timer | |||
| Scales | |||
| 70% ethanol wipes |
References
- Schreiber, A., et al. Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 303 (5), F783-F788 (2012).
- Friedemann, J., et al. Improved kinetic model for the transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in experimental animals. Kidney International. 90 (6), 1377-1385 (2016).
- Schock-Kusch, D., et al. Reliability of transcutaneous measurement of renal function in various strains of conscious mice. PLoS One. 8 (8), e71519 (2013).
- Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney International. 79 (11), 1254-1258 (2011).
- Herrera Pérez, Z., Weinfurter, S., Gretz, N. Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents. Journal of Visualized Experiments. (109), 53767 (2016).
- Cowley, A. W., et al. Progression of glomerular filtration rate reduction determined in conscious Dahl salt-sensitive hypertensive rats. Hypertension. 62 (1), 85-90 (2013).
- Scarfe, L., et al. Measures of kidney function by minimally invasive techniques correlate with histological glomerular damage in SCID mice with adriamycin-induced nephropathy. Scientific Reports. 5, 13601 (2015).
- Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
- Street, J. M., et al. The role of adenosine 1a receptor signaling on GFR early after the induction of sepsis. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 314 (5), F788-F797 (2018).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Wang, W., et al. Endotoxemic acute renal failure is attenuated in caspase-1-deficient mice. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 288 (5), F997-F1004 (2005).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
- Bankir, L., Yang, B. New insights into urea and glucose handling by the kidney, and the urine concentrating mechanism. Kidney International. 81 (12), 1179-1198 (2012).
- Qi, Z., et al. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 286 (3), F590-F596 (2004).
- Peters, A. M. The kinetic basis of glomerular filtration rate measurement and new concepts of indexation to body size. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 31 (1), 137-149 (2004).
- Chapman, M. E., Hu, L., Plato, C. F., Kohan, D. E. Bioimpedance spectroscopy for the estimation of body fluid volumes in mice. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 299 (1), F280-F283 (2010).
