Summary

В естественных условиях метод для изучения целостности барьер крови яички мыши

Published: December 02, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол для оценки целостности барьер крови яичка путем впрыскивать инулин FITC в яичках. Это эффективно в vivo метод для изучения крови яички барьер целостности, которая может быть скомпрометирована генетических и экологических элементов.

Abstract

Сперматогенез является развитие сперматогонии в зрелых сперматозоидов в семенных канальцев яичек. Этот процесс поддерживается соединения клеток Сертоли на крови яички барьер (BTB), который является плотные ткани барьер в организме млекопитающих и сегрегирует семенных эпителия в двух отсеков, базальный и adluminal. BTB создает уникальный микроокружение для клетки семенозачатка в мейоз I / II и для развития postmeiotic сперматид в сперматозоидов через spermiogenesis. Здесь мы описываем надежный пробирного контролировать целостность BTB мыши яичка в естественных условиях. Нетронутыми BTB блокирует распространение FITC-конъюгированных инулин из базальных апикальной отсек семенных канальцев. Этот метод подходит для изучения генов кандидатов, вирусы или экологических токсикантов, которые могут повлиять на функцию BTB или целостность, с простой процедурой и минимальное требование хирургических навыков, по сравнению с альтернативными методами.

Introduction

У млекопитающих сперматогенез считается весьма структурированный процесс, который охватывает сперматогониальные самообновлению и дифференциация через сперматоцитах в haploid сперматозоидов через митоз, мейоз и spermiogenesis, во время которого драматического биохимические и морфологические изменения происходят. Постепенно развивающиеся клетки семенозачатка перевозятся от основания семенных канальцах сторону просвета. Этот процесс регулируется ячеек контактов между зародышевых клеток и клеток Сертоли1,2. Соседние клетки Сертоли образуют BTB, который расположен рядом с базой семенных канальцах. BTB физически делит эпителия на базальную и adluminal отделения. Во время этапа VIII – IX эпителиальных цикла, сперматоцитах preleptotene/leptotene от базальной отсеков мигрируют по BTB, ввод в adluminal отсеков3. Таким образом функция BTB является предоставить immunoprivileged микроокружение для завершения мейоза и spermiogenesis4,5,6. В отличие от других крови тканевые барьеры (например, blood – brain барьер) которые состоят только из плотных узлов (сомони) BTB формируется четыре различных узлов (сомони, ectoplasmic специализаций, разрыв соединения и среднего на основе накаливания Десмосомы) между Сертоли клетки1,7.

Многие исследования использовали генетически измененных мышей, вирусных инфекций и экологических токсикантов расследовать механизмов BTB целостности7,8,9. BTB срыв индуцирует нарушение сперматогенеза и менструальной или бесплодия. Поскольку формирование БТБ и целостность были подтверждены пострадать от контактов между клеток Сертоли8, была использована модель в пробирке , основанный на первичной культуре изолированных клеток Сертоли BTB исследования. Однако эта модель не может точно имитировать BTB динамика в естественных условиях. Кроме того нет такого совместного культуры зародышевых клеток с клеток Сертоли был создан как способной отражать всех соответствующих структурных и функциональных компонентов BTB10,11.

В общем в естественных условиях BTB целостности анализов обычно основаны на малых молекул, как EZ-Link сульфогруппу-ГСЗ-LC-биотин и конъюгированных FITC инулин (инулин FITC). Как правило распространение биотин или инулина FITC от базальной отсека блокируется BTB структуры. Таким образом мы имеем возможность использовать этот метод для оценки масштабов ущерба BTB, по сравнению с контрольными группами. В то время как BTB может быть скомпрометирована с определенными типами раздражителей, таких как лечение с Кадмий хлористый (2CdCl)12, BTB становится доступной для малых молекул, которые в конечном итоге войти в adluminal отделение как индикаторы.

Начале в vivo BTB целостности assay включает инъекции биотина или инулина FITC в яремной вены, которая включает операции и инвазивных, сложным и трудоемким. Кроме того как репортер веществ диффузной через все тело через кровообращение, местные концентрация биотина или инулина FITC в семенных канальцев ограничен. Кроме того системного воздействия могут вызвать иммунных реакций. Здесь мы представляем простой и эффективный в vivo BTB целостности пробирного включение прямого впрыска небольшой Алиготе инулин FITC в интерстиции яичка. Флуоресцентные метки метода, процесс окрашивания удобно использовать, как вторичные антитела не требуются. Здесь визуализировать процесс Люминесцентную краску, введя яички.

Protocol

Все выполненные эксперименты на животных были утверждены Комитетом медицинского университета Нанкин. Самцов мышей C57BL/6 хранились в контролируемых фотопериода условиях и были поставлены с пищей и водой. 1. Подготовка Микроинъекции капилляров Исполь?…

Representative Results

Экспериментальная установка для выполнения анализа целостности BTB показан на рисунке 1. Тянуть и точить микроинъекции капилляров с капиллярной съемник и микропипеткой оборудованием, соответственно (рис. 1A и 1 C). Термостатическ…

Discussion

Сперматогенез занимает место в эпителии семенных и является весьма упорядоченный и динамичный процесс, который регулируется зародышевых клеток и соматических клеток (например, клеток Сертоли)13. BTB структуры, которая построена путем клеток Сертоли, делит семенны?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана национальной ключ R & D программы Китая (2016YFA0500902), Национальный фонд Китая естественных наук (31471228, 31771653), научный фонд Цзянсу для выдающихся молодых ученых (BK20150047), естественные науки Фонд провинции Цзянсу (BK20140897, 14KJA180005) и инновационной и предпринимательской программы провинции Цзянсу на К.Ж

Materials

Capillary puller  SUTTER INSTRUMENT (USA) P-97
10x PBS Hyclone (USA) SH30258.01 dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma (USA) F6057
Adhesion microscope slides CITOGLAS (China) 80312-3161
Cadmium chloride Sigma (USA) 655198-5G
Confocal microscope Zeiss (Germany) LSM700
Dust-free paper Kimberly-Clark (USA) 34120
Inulin-FITC Sigma (USA) F3272
Microinjection capillaries Zhengtianyi (China) BJ-40 1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler NARISHIGE (JAPAN) EG-400
OCT SAKURA (JAPAN) 4583
Paraformaldehyde Sigma (USA) P6148
Pentobarbital sodium Merck (Germany) P11011
Shaver  Yashen (China)
Stereo microscope Nikon (JAPAN) SMZ1000
Sucrose  Sangon Biotech (China) A610498
Surgical instruments Stronger (China) scissors, forceps, needle holder
Syringe KDL (China) 20163150518 0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater KELL (Nanjing, China) KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris Sangon Biotech (China) A600194
1.37 M Nacl Sangon Biotech (China) A610476

References

  1. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
  2. Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).
  3. Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
  4. Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
  5. O’Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?. Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
  6. Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
  7. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
  8. Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
  9. Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
  10. Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
  11. Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
  12. Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the ‘blood-testis barrier’ after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
  13. Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
  14. Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
  15. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
  16. Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
  17. Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?. Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
  18. Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
  19. Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
  20. Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
  21. Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).

Play Video

Cite This Article
Liu, M., Zhu, C., Bai, S., Li, X., Fu, K., Ye, L., Zheng, K. An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity. J. Vis. Exp. (142), e58512, doi:10.3791/58512 (2018).

View Video