Здесь мы представляем протокол для оценки целостности барьер крови яичка путем впрыскивать инулин FITC в яичках. Это эффективно в vivo метод для изучения крови яички барьер целостности, которая может быть скомпрометирована генетических и экологических элементов.
Сперматогенез является развитие сперматогонии в зрелых сперматозоидов в семенных канальцев яичек. Этот процесс поддерживается соединения клеток Сертоли на крови яички барьер (BTB), который является плотные ткани барьер в организме млекопитающих и сегрегирует семенных эпителия в двух отсеков, базальный и adluminal. BTB создает уникальный микроокружение для клетки семенозачатка в мейоз I / II и для развития postmeiotic сперматид в сперматозоидов через spermiogenesis. Здесь мы описываем надежный пробирного контролировать целостность BTB мыши яичка в естественных условиях. Нетронутыми BTB блокирует распространение FITC-конъюгированных инулин из базальных апикальной отсек семенных канальцев. Этот метод подходит для изучения генов кандидатов, вирусы или экологических токсикантов, которые могут повлиять на функцию BTB или целостность, с простой процедурой и минимальное требование хирургических навыков, по сравнению с альтернативными методами.
У млекопитающих сперматогенез считается весьма структурированный процесс, который охватывает сперматогониальные самообновлению и дифференциация через сперматоцитах в haploid сперматозоидов через митоз, мейоз и spermiogenesis, во время которого драматического биохимические и морфологические изменения происходят. Постепенно развивающиеся клетки семенозачатка перевозятся от основания семенных канальцах сторону просвета. Этот процесс регулируется ячеек контактов между зародышевых клеток и клеток Сертоли1,2. Соседние клетки Сертоли образуют BTB, который расположен рядом с базой семенных канальцах. BTB физически делит эпителия на базальную и adluminal отделения. Во время этапа VIII – IX эпителиальных цикла, сперматоцитах preleptotene/leptotene от базальной отсеков мигрируют по BTB, ввод в adluminal отсеков3. Таким образом функция BTB является предоставить immunoprivileged микроокружение для завершения мейоза и spermiogenesis4,5,6. В отличие от других крови тканевые барьеры (например, blood – brain барьер) которые состоят только из плотных узлов (сомони) BTB формируется четыре различных узлов (сомони, ectoplasmic специализаций, разрыв соединения и среднего на основе накаливания Десмосомы) между Сертоли клетки1,7.
Многие исследования использовали генетически измененных мышей, вирусных инфекций и экологических токсикантов расследовать механизмов BTB целостности7,8,9. BTB срыв индуцирует нарушение сперматогенеза и менструальной или бесплодия. Поскольку формирование БТБ и целостность были подтверждены пострадать от контактов между клеток Сертоли8, была использована модель в пробирке , основанный на первичной культуре изолированных клеток Сертоли BTB исследования. Однако эта модель не может точно имитировать BTB динамика в естественных условиях. Кроме того нет такого совместного культуры зародышевых клеток с клеток Сертоли был создан как способной отражать всех соответствующих структурных и функциональных компонентов BTB10,11.
В общем в естественных условиях BTB целостности анализов обычно основаны на малых молекул, как EZ-Link сульфогруппу-ГСЗ-LC-биотин и конъюгированных FITC инулин (инулин FITC). Как правило распространение биотин или инулина FITC от базальной отсека блокируется BTB структуры. Таким образом мы имеем возможность использовать этот метод для оценки масштабов ущерба BTB, по сравнению с контрольными группами. В то время как BTB может быть скомпрометирована с определенными типами раздражителей, таких как лечение с Кадмий хлористый (2CdCl)12, BTB становится доступной для малых молекул, которые в конечном итоге войти в adluminal отделение как индикаторы.
Начале в vivo BTB целостности assay включает инъекции биотина или инулина FITC в яремной вены, которая включает операции и инвазивных, сложным и трудоемким. Кроме того как репортер веществ диффузной через все тело через кровообращение, местные концентрация биотина или инулина FITC в семенных канальцев ограничен. Кроме того системного воздействия могут вызвать иммунных реакций. Здесь мы представляем простой и эффективный в vivo BTB целостности пробирного включение прямого впрыска небольшой Алиготе инулин FITC в интерстиции яичка. Флуоресцентные метки метода, процесс окрашивания удобно использовать, как вторичные антитела не требуются. Здесь визуализировать процесс Люминесцентную краску, введя яички.
Сперматогенез занимает место в эпителии семенных и является весьма упорядоченный и динамичный процесс, который регулируется зародышевых клеток и соматических клеток (например, клеток Сертоли)13. BTB структуры, которая построена путем клеток Сертоли, делит семенны?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана национальной ключ R & D программы Китая (2016YFA0500902), Национальный фонд Китая естественных наук (31471228, 31771653), научный фонд Цзянсу для выдающихся молодых ученых (BK20150047), естественные науки Фонд провинции Цзянсу (BK20140897, 14KJA180005) и инновационной и предпринимательской программы провинции Цзянсу на К.Ж
Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
Shaver | Yashen (China) | ||
Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
10x TBS, pH 7.6 | |||
0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |