أسلوب في فيفو لدراسة سلامة حاجز الدم-الخصية الماوس
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم سلامة حاجز الدم-الخصية عن طريق حقن الاينولين-فيتك في الخصيتين. هذا هو أسلوب فعال في فيفو لدراسة سلامة حاجز الدم-الخصية التي يمكن أن تتأثر بالعناصر الوراثية والبيئية.
Abstract
الحيوانات المنوية هو تطوير spermatogonia إلى المني ناضجة في الخصي للخصية. ويدعم هذه العملية تقاطعات خلية سيرتولي على حاجز الدم-الخصية (الفيرمونت)، وهو أشد الحاجز الأنسجة في جسم الثدييات ويعزل ظهارة سيمينيفيروس في مقصورات اثنين، القاعدية وأدلومينال. BTB يخلق المكروية فريدة من نوعها للخلايا الجرثومية في الانقسام الاختزالي أنا/الثاني ومن أجل تطوير بوستميوتيك لوحظت في المني عن طريق سبيرميوجينيسيس. هنا، يمكننا وصف مقايسة موثوق بها رصد سلامة BTB الماوس الخصية في فيفو. BTB سليمة كتل نشر مترافق FITC الاينولين من القاعدية لحجرة قمي للخصي. هذا الأسلوب مناسبة لدراسة الجينات المرشحين أو الفيروسات أو السموم البيئية التي قد تؤثر على دالة BTB أو السلامة، مع إجراء سهل واشتراط الحد أدنى من المهارات الجراحية مقارنة بالأساليب البديلة.
Introduction
وتعتبر الثدييات الحيوانات المنوية عملية التنظيم تضم spermatogonial الذاتي تجديد والتمايز من خلال سبيرماتوسيتيس في المني فرداني عن طريق الانقسام، والانقسام، وسبيرميوجينيسيس، خلالها مثيرة تحدث التغييرات البيوكيميائية والمورفولوجية. يتم نقل الخلايا الجرثومية النامية تدريجيا من قاعدة أنبوب seminiferous نحو التجويف. وينظم هذه العملية خلية خلية الاتصالات بين الخلايا الجرثومية وخلايا سيرتولي1،2. تشكيل خلايا سيرتولي مجاورة BTB الذي يقع قرب القاعدة لأنبوب سيمينيفيروس. الفيرمونت جسديا يقسم الظهارة القاعدية وحجرة أدلومينال. خلال مراحل الثامن-التاسع دورة الظهارية، ترحيل سبيرماتوسيتيس بريليبتوتيني/leptotene من المقصورات القاعدية عبر الفيرمونت، دخول المقصورات أدلومينال3. ولذلك، وظيفة BTB توفير المكروية إيمونوبريفيليجيد لإنهاء الانقسام وسبيرميوجينيسيس4،،من56. خلافا للدم-الأنسجة حواجز أخرى (مثلاً، حاجز الدم في الدماغ) التي تتكون فقط من تقاطعات ضيق (TJs)، BTB شكلتها أربعة تقاطعات مختلفة (TJs التخصصات ectoplasmic وتقاطعات الفجوة، والمتوسطة المستندة إلى خيوط desmosomes) بين Sertoli الخلايا1،7.
واستخدمت العديد من الدراسات الفئران المعدلة وراثيا، وحالات العدوى بالفيروس، وسميات البيئية للتحقيق في آليات BTB السلامة7،،من89. تعطيل BTB يدفع ضعف الحيوانات المنوية والحيضيه أو العقم. منذ تشكيل BTB وسلامة تأكدت أن تتأثر الاتصالات بين خلايا سيرتولي8، نموذجا في المختبر استناداً إلى الثقافة الأولية من خلايا سيرتولي معزولة وقد استخدمت لدراسة الفيرمونت. ومع ذلك، لا يمكن دقة تقليد هذا النموذج BTB ديناميات فيفو. وعلاوة على ذلك، تم إنشاء لا ثقافة المشارك هذه الخلايا الجرثومية مع خلايا سيرتولي كما يمكن أن يعكس جميع المكونات الهيكلية والوظيفية ذات الصلة من10،BTB11.
وبصفة عامة، في فيفو BTB سلامة فحوصات عادة استناداً إلى جزيئات صغيرة، مثل وصلة لوبيس سولفو-دائرة الصحة الوطنية–LC-البيوتين ومترافق FITC inulin (الاينولين-فيتك). عادة، يتم حظر نشر البيوتين أو الاينولين-فيتك من حجرة القاعدية بهيكل الفيرمونت. ولذلك، نحن قادرون على استخدام هذا الأسلوب لتقييم مدى الضرر BTB مقارنة مع مجموعات المراقبة. بينما يمكن أن يثير الشبهة BTB مع أنواع معينة من المنبهات، مثل المعاملة مع (كدكل2) كلوريد الكادميوم12، يصبح BTB موجوداً للجزيئات الصغيرة، الذي أدخل حجرة أدلومينال في نهاية المطاف كمؤشرات.
أوائل في فيفو BTB سلامة مقايسة ينطوي على حقن البيوتين أو الاينولين-فيتك في حبل الوريد، الذي ينطوي على جراحة، والغازية، ومعقدة وتستغرق وقتاً طويلاً. إلى جانب ذلك، كالمواد مراسل منتشر عبر الجسم كله عن طريق الدورة الدموية، يقتصر تركيز المحلية البيوتين أو الاينولين-فيتك في الخصي. وعلاوة على ذلك، قد حمل التعرض للمنهجية ردود فعل المناعة. نقدم هنا، بسيطة وفعالة في فيفو BTB سلامة مقايسة تمكين الحقن المباشر قاسمة صغيرة من الاينولين فيتك في إينتيرستيتيوم للخصية. استخدام الفلورية وسم الأسلوب، عملية المصبوغة مريحة، كما الأجسام المضادة الثانوية غير مطلوبة. وهنا، هو تصور عملية صبغة الفلورسنت الدخول في الخصية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يأخذ مكانة في ظهارة سيمينيفيروس الحيوانات المنوية وهو عملية مرتبة للغاية والدينامية التي تحكمها الخلايا الجرثومية وخلايا جسدية (مثلاً، خلايا سيرتولي)13. هيكل الفيرمونت، الذي يتكون من خلايا سيرتولي، يقسم ظهارة سيمينيفيروس القاعدية وحجرة قمي. تنمية الخلايا الجرثومي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها R مفتاح الوطنية & د البرنامج الصيني (2016YFA0500902)، الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (31471228, 31771653)، ومؤسسة العلوم جيانغسو “العلماء الشبان البارزين” (BK20150047)، العلوم الطبيعية مؤسسة من مقاطعة جيانغسو (BK20140897، 14KJA180005) والبرنامج المبتكرة والمشاريع الخاصة من مقاطعة جيانغسو إلى K.Z.
Materials
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
References
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).
- Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
- O’Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?. Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
- Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
- Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
- Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
- Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
- Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
- Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the ‘blood-testis barrier’ after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
- Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
- Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
- Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?. Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
- Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
- Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).
