Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Andr&#233; Gemeinhardt; Matthew P. McDonald; Katharina K&#246;nig; Michael Aigner; Andreas Mackensen; Vahid Sandoghdar

doi:10.3791/58486

JoVE Journal > Engineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Engineering

Label-Free Imaging van één eiwitten uitgescheiden door levende cellen via iSCAT microscopie

Published: November 20, 2018

doi:

10.3791/58486

André Gemeinhardt¹, Matthew P. McDonald^1,2, Katharina König^1,3, Michael Aigner⁴, Andreas Mackensen⁴, Vahid Sandoghdar^1,3

¹Max Planck Institute for the Science of Light (MPL), ²Area of Scientific Learning,Milligan College, ³Department of Physics,Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg, ⁴Department of Internal Medicine 5, Hematology and Oncology,Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg (FAU), University Hospital Erlangen

Summary

We presenteren een protocol voor de real-time optische detectie van één labelloze eiwitten zoals ze worden uitgescheiden uit levende cellen. Dit is gebaseerd op de microscopie interferometrische verstrooiing (iSCAT), die kan worden toegepast op een verscheidenheid van verschillende biologische systemen en configuraties.

Abstract

We tonen de interferometrische verstrooiing (iSCAT) microscopie, een methode voor het opsporen van één labelloze eiwitten uitgescheiden door individuele levende cellen in real time van. In dit protocol behandelen wij de fundamentele stappen voor het realiseren van een iSCAT-Microscoop en aanvullen met extra imaging kanalen om te controleren de levensvatbaarheid van een cel bestudeerde. Na dit gebruiken we de methode voor real-time detectie van enkele eiwitten zoals ze worden uitgescheiden van een levende cel waaruit we met een vereeuwigd B-cel-lijn (Laz388). Nodige maatregelen betreffende de voorbereiding van de Microscoop en monster alsook de analyse van de vastgelegde gegevens worden besproken. Het protocol van de video toont aan dat iSCAT microscopie biedt een eenvoudige methode om te studeren secretie op het niveau van de single-molecuul.

Introduction

Secreted eiwitten spelen een belangrijke rol in verschillende fysiologische processen¹. Hierdoor worden zij routinematig bestudeerd als een collectieve ensemble (proteomics) of als afzonderlijke entiteiten²^,³. Proteomics onderzoekt traditioneel de hele set van eiwitten aanwezig zijn in een bepaald biologisch systeem door middel van bijvoorbeeld enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), stroom cytometry of massaspectrometrie⁴^,⁵^, ⁶. Aan de andere kant, zijn één eiwitten, over het algemeen gedetecteerd met behulp van een verscheidenheid van technieken die zijn gebaseerd op de fluorescentie⁷^,⁸, plasmonics⁹^,¹⁰, of cryogene elektron¹¹ microscopies. Al deze technieken gebruik van complexe instrumenten, labelen, of beide en ontbreekt het vaak aan dynamiek informatie zoals zij alleen op lange termijn informatie over het systeem onder studie leveren.

Hier gebruiken we iSCAT¹²^,¹³ microscopie aan gevoel individuele secretoire eiwitten met sub tweede temporele resolutie¹⁴. Nog belangrijker is, detecteert de techniek het zwakke verspreide signaal inherent is aan iedere eiwit¹²^,¹⁴. De hoeveelheid licht die een kleine bioparticle verstrooit schalen met haar polarizability. Ervan uitgaande dat de vorm van een eiwit kan worden benaderd door een effectieve verstrooiing bol¹⁴^,¹⁵^,¹⁶, en dat verschillende eiwitten hebben zeer vergelijkbaar brekingsindices, de gemeten signaal rechtstreeks kan worden aangesloten op het molecuulgewicht (MW) van het eiwit. De empirische kalibratie van iSCAT contrast versus moleculair gewicht door referentiemetingen kan men onderscheiden van proteïnen van verschillende maten. iSCAT experimenten kunnen gemakkelijk worden aangevuld met fluorescentie microscopie¹⁷^,¹⁸, immunosorbent reagentia, evenals TL of verstrooiing etiketten te maken voor een specifieke detectie van een proteïne van belang¹⁴ ^, ¹⁷ ^, ¹⁹.

In principe functioneert iSCAT door het sturen van een eiwit zwakke verstrooide licht via de interferometrische mengen met een secundaire verwijzing Golf. De gedetecteerde intensiteit () in een iSCAT Microscoop wordt beschreven door

waar is de incident intensiteit, is een coëfficiënt voor de bijdrage van de referentie-Golf, betekent de kracht van de verstrooiing van de nano-object onder studie, en is de faseverschuiving tussen de verspreide en verwijst naar golven¹⁴. Ofwel het verzonden of gereflecteerd, rug incident licht wordt meestal gebruikt als een referentie-Golf, waar in elk geval rekeningen voor de transmissivity of de reflectiviteit van de monsterkamer, respectievelijk. De term is evenredig aan het eiwit van verstrooiing cross sectie en kan worden verwaarloosd t.o.v. de cross term. Aldus, de vaststelling van voor volledige destructieve interferentie, het gedetecteerde licht wordt gegeven door waar is de intensiteit van de verwijzing en is de intensiteit van de storing.

iSCAT microscopie biedt een uitstekende methode om te bestuderen van de biologische processen op het niveau van de single-molecuul. Als voorbeeld, onderzoeken we de Laz388 cellen — een Epstein – Barr virus (EBV) getransformeerd B-lymfocyt cel lijn²⁰^,²¹ — zoals ze eiwitten zoals IgG antilichamen^{16 afscheiden}. Echter, de methode is algemeen en kan worden toegepast op een verscheidenheid van andere biologische systemen. iSCAT is inherent aspecifieke en eiwit kan detecteren of nanoparticle, of het kan worden uitgebreid met gemeenschappelijk oppervlak functionalization methoden voor de detectie van de specifieke of multiplexed. De eenvoud en de mogelijkheid om te worden gecombineerd met andere optische technieken, zoals fluorescentie microscopie, maken van iSCAT een waardevolle aanvullend instrument in de celbiologie.

Protocol

Let op: Lees alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voordat het gebruik van alle chemische stoffen, alle passende veiligheidspraktijken observeren en dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (laser veiligheidsbril, handschoenen, oogbescherming, Laboratorium jassen) zoals nodig. 1. opbouw van de iSCAT Microscoop16,18 Opmerking: De iSCAT-Microscoop bestaat meestal uit een gemodificeerde omgekeerde Microscoop setup. Kortom, een laser is gericht op het terug brandvlak van de doelstelling van een hoge numerieke diafragma (nvt) en een imaging lens wordt gebruikt voor het richten van het deeltje back-verstrooid licht op een camera chip. In het algemeen, kan deze Microscoop breed-gebied worden gebouwd vanaf nul of op basis van een bestaande omgekeerde Microscoop. Dit protocol omvat de essentiële stappen voor het realiseren van de setup, terwijl wijzigingen in de gebruikte hardware mogelijk zijn. Een meer gedetailleerde beschrijving van de vergadering van een iSCAT-Microscoop kan worden gevonden in het werk van Arroyo et al. 18. Let op: Een iSCAT Microscoop houdt een klasse IIIB tot klasse IV laser-lichtbron. Passende oogbescherming is noodzakelijk wanneer het assembleren en uitlijnen van de Microscoop optica. Tijdens de vergadering van de Microscoop, ervoor te zorgen dat de laser beam pad rechte blijft en niet wordt afgebogen als nieuwe optische onderdelen worden toegevoegd. Het pad van de verlichting van de Microscoop opgericht. Met behulp van een gedempte optische tafel en een stijve metalen blok, het bouwen van een Microscoop monster etappe18 , waarin de doelstelling van een hoge numerieke diafragma (NB) (100 X / 1,46 nb) en een vertaaleenheid die het mogelijk voor laterale monster vertaling evenals verandering van focus maakt positie voor het doel.Opmerking: Bediening van de Microscoop van een iSCAT op de grens van het opsporen van enkele eiwitten is zeer gevoelig voor externe trillingen. Een centrosymmetric piezo fase die ondersteuning biedt voor het monster van alle kanten wordt aanbevolen om het beperken van akoestische excitaties van het monster dat anders in gevaar focal en laterale stabiliteit brengt zou. Figuur 1 toont een geschikt monster stadia, met inbegrip van de doelstelling en de piëzo-vertaaleenheid. Daarnaast is het aanbevolen dat massale en stabiele beugels worden gebruikt voor alle optische componenten besproken in de volgende stappen. Dergelijke onderdelen zijn gemakkelijk verkrijgbaar bij leveranciers van commerciële optica. Gebruik een 50 cm brandpuntsafstand singlet lens (breed-gebied lens) en een 45° (verticaal) koppeling mirror om te richten van het licht van een diodelaser op golflengte 445 nm op het terug brandvlak van de doelstelling. Dit zal creëert een collimated balk op de doelstelling van voorwaartse focus en de bron iSCAT verlichting. Eventueel filteren de laser ruimtelijk vóór de lens van de 50 cm via een 30 µm pinhole of enkelvoudige modus vezel. Een droplet immersie-olie van toepassing op het doel en plaats een dekglaasje glas aan in het vlak van de steekproef van de Microscoop fase. Dit zal resulteren in een balk die terug naar beneden door de imaging doelstelling weerspiegelt.Opmerking: De reflectie vloeit voort uit de lucht-glas-interface op de bovenkant van het monster dekglaasje aan en zal dienen als basis voor de referentiestraal iSCAT. Resterende vuil of stof op het oppervlak van het dekglaasje aan zal aanleiding geven tot verstrooiing puntbronnen, die helpen bij de juiste aandacht van de beeldvorming doelstelling in de volgende stappen.Let op: De meerderheid van het laserlicht verzendt via het dekglaasje aan en reist recht omhoog uit de doelstelling. Plaats een ondoorzichtige spiegelende diffusor (bv., een papieren kaart) boven het dekglaasje aan om te minimaliseren van het risico van verwonding van het laserlicht. Figuur 1: iSCAT monster fase. De foto toont het massieve aluminium blok waarop de piezo vertaaleenheid (zwart) is gemonteerd evenals de gecentreerde 100 x doelstelling. De fase 3 assen piezo zorgt voor nauwkeurige positionering van het monster in het brandvlak van de doelstelling. Grof gericht wordt uitgevoerd door het draaien van een schroefdraad buis waarop de doelstelling wordt gemonteerd (niet afgebeeld). Het blok wordt geplaatst op de optische tafel met vier stalen containers boven de 45° koppeling spiegel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Instellen van het grafische pad van de Microscoop. Invoering van een antireflection (AR)-gecoat balk splitter (70% reflectie, 30% overdracht) in een hoek van 45° ten opzichte van de invallende lichtbundel, en ongeveer 10 cm na het breed-gebied objectief. Wijzen de AR-coating op de laserbron. Dit zendt de invallende lichtbundel, en weerspiegelt de verwijzing en verspreid balken in een hoek van 90° aan de invallende lichtbundel.Opmerking: AR-coating en/of steken beam splitters worden aanbevolen als significante beeldschaduwen en marginale effecten optreden kunnen bij het gebruik van de lichtbundel splitsen kubussen of ongecoate vlakke beam splitters. Zie de discussie voor meer details. Indien gewenst, kan elke ongewenste weerkaatste lichtbundel die voortvloeien uit de achterzijde van de balk splitter worden geblokkeerd door gebruik van een membraan van iris. Een dikke balk splitter zal een aanzienlijke lichtbundel verplaatsing introduceren, zodat de laser kan het doel niet direct meer invoeren. Indien nodig, opnieuw uitlijnen de laser beam pad vóór de balk splitter om ervoor te zorgen de juiste verspreiding via de doelstelling.Opmerking: De balk splitter kan ook worden toegevoegd voordat de brede lens van het veld en het stadium van de Microscoop is geplaatst (in stap 1.1.2.), zodanig dat de balk zal niet hoger kunnen verschuiven. Op dit moment richten de imaging arm van de interferometer en ervoor zorgen dat het monster vlak en de camera parfocal. Plaats een concave f =-45 cm lens op een positie 5 cm na het breed-gebied objectief in het pad van de invallende lichtbundel. Dit zal resulteren in een collimated balk invoeren van het terug diafragma van de doelstelling. Met een scherm geplaatst in de gereflecteerde tak van de interferometer, verplaatst u de doelstelling in verticale richting om de grof focal positie te vinden. Het doel is in focus wanneer het licht raken van het scherm is collimated.Let op: Afbeelding 2 ziet u een schematische voorstelling van dit proces. Verwijderen van zowel de f =-45 cm lens en het scherm wanneer grof gericht voltooid is.Opmerking: In plaats van een negatieve brandpuntsafstand lens, het breed-gebied objectief zelf kan worden geplaatst op een beweegbare mount en verschoven uit het pad van de lichtbundel voor deze stap. Om te bereiken de meest stabiele Microscoop configuratie, is het echter raadzaam om te houden van de lens van het breed-gebied in een vaste positie. Toevoegen van een tweede f = 50 cm singlet lens te concentreren het verstrooide licht en te collimate het gereflecteerde licht op de sensor van een CMOS camera. Ervoor zorgen dat de lens 50 cm vanaf het terug brandvlak van de doelstelling om opnieuw collimate de referentiestraal en richten het verstrooide licht is geplaatst. Plaats de CMOS-chip 50 cm afstand van de f = 50 cm lens en de positie van de lichtbundel rechtstreeks op het midden van de chip.Opmerking: De volgende parameters worden doorgaans gebruikt voor imaging. Het vermogen van de laser (golflengte 445 nm) is ingesteld op 100 mW. Pinhole en balk splitter verzachten de doorvallend licht zodat het effectiefvermogen invoeren van de doelstelling is ongeveer 9 mW. De diameter van de lichtbundel op de positie van de steekproef bedraagt 6 µm. Met de gebruikte beeldvormende lens is de effectieve vergroting van het systeem ongeveer 300 x. De grootte van de afbeelding op de CMOS-chip is ingesteld op 128 × 128 pixels binnen de verlichte gebied, resulterend in een gezichtsveld van circa 5 × 5 µm2. Figuur 3 toont een schema van het volledig geassembleerde iSCAT Microscoop. Figuur 2: grof concentreren van de Microscoop iSCAT. Het schema toont de plaatsing van de optica helpen brengen het systeem in beeld. De achterzijde van de balk splitter met AR-coating (70/30 BS) is gemarkeerd in het rood. Belangrijke afstanden vindt u in het groen. De brandpunten (f) van de lenzen gebruikt worden aangeduid. Onderdelen in het blauw gestreepte vak worden toegevoegd in stappen 1.2.6 – 1.2.7. De concaaf lens (gebruikt voor het opnieuw collimate de convergerende lichtbundel van iSCAT) en het scherm zijn later verwijderd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: Microscoop iSCAT. Het schema toont het volledig geassembleerde iSCAT Microscoop. De achterzijde van de balk splitter met AR-coating (70/30 BS) is gemarkeerd in het rood. Belangrijke afstanden vindt u in het groen. De brandpunten (f) van de lenzen gebruikt worden aangeduid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Extra imaging kanalen instellen.Opmerking: Deze sectie voegt een ander imaging pad aan de Microscoop die zorgt voor de waarneming van een groot gebied rond de iSCAT laser via heldere field-microscopie, en om te controleren de levensvatbaarheid van de cellen via fluorescentie microscopie. De output van een LED-lichtbron (echt) paar (ongeveer 500 nm < λ < 580 nm) in een lange afstand 20 X / 0.4 nb doelstelling werken, en te installeren van mechanische onderdelen boven de monsterkamer waarmee voor zich te concentreren en laterale positionering van de output van de LED op de monster. Zorg ervoor dat de LED de uitgang spectrum dekt van het bereik van de excitatie van de cel dood markering (propidium jodide (PI)) en interfereert niet met haar fluorescentie (λ > 600 nm). Gebruik optische filters indien nodig. Verplaats de bovenste doelstelling lateraal zodat de bovenste (breed-gebied) en lagere (iSCAT) doelstellingen collineair zijn. Dit wordt bepaald door het plaatsen van een scherm onder de lagere doelstelling en het maximaliseren van de intensiteit van doorvallend LED licht op het scherm. Plaats een λ = 550 nm korte-pass dichroïde spiegel (SPDM) te splitsen de overdraagbare LED licht van het pad van de laser iSCAT. Deze lichtbundel gesplitst in twee kanalen met een 8% reflective/92% transmissive balk splitter (BS). Het pad van 92% is de fluorescentie-kanaal en het pad van 8% wordt gebruikt voor helder-veld imaging. Afbeelding van het kanaal van de heldere-veld op een CMOS-camera met behulp van een f = 5 cm Achromatische doublet lens. Afbeelding van het kanaal van de fluorescentie op een aparte CMOS-camera met behulp van een f = 5 cm Achromatische doublet lens en een λ = 600 nm long pass filter om de excitatie-licht blokkeren. Figuur 4a toont een schema van het volledig geassembleerde Microscoop met inbegrip van alle imaging kanalen. Figuur 4: iSCAT microscopie van eiwitten uitgescheiden door afzonderlijke cellen. (a) schematische van de Microscoop beschreven in het protocol. Zie sectie 1 voor meer informatie. Afkortingen: LED, LED; SPF, korte-pass filter; obj, doelstelling; SPDM, korte-pass dichroïde spiegel; BS, balk splitter; LPF, long pass filter; BF, helder-gebied; fluor, fluorescentie; C1-C3, camera 1-3. (b) Bright-veld afbeelding van een enkele cel Laz388 ongeveer 4 µm buiten het gezichtsveld van iSCAT (afgebeeld door een wit vierkantje). Foto genomen door de camera C3, schaal bar: 10 µm. (c) fluorescentie beeld van dezelfde regio weergegeven in (b) met de positie van de cel gemarkeerd met een witte cirkel. Het ontbreken van fluorescentie geeft aan dat de cel levensvatbaar is. Foto genomen door de camera C2, schaal bar: 10 µm. (d) Raw iSCAT camera beeld momentopname met 80 µs blootstellingstijd. Foto genomen door de camera C1. (e) iSCAT afbeelding van dezelfde regio na Spatio achtergrond aftrekken zoals beschreven in de sectie discussie. Het beeld werd geïntegreerd over 1000 sequentiële ruwe frames (d) met een tijd van laatste frame van 400 ms en onthult de oppervlakteruwheid van het glas dekglaasje aan. (f) overeenkomstige differentiële iSCAT afbeelding waarin de bindende gebeurtenis van 2 eiwitten op het dekglaasje aan. Het beeld werd gebouwd door het aftrekken van twee opeenvolgende gefilterde beelden (e). Schaal bars in (d), (e) en (f): 1 µm. Dit percentage is aangepast van McDonald, M.P. et al. 16. copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Instellen van de computer en software. Alle camera’s op een computer aansluiten. Respectieve stuurprogrammapakketten installeren en verkrijgen/schrijven software voor hun controle.Opmerking: Geschikte hardware is nodig voor snelle overnames. Minimaal worden een multi-core processor, 16 GB RAM, een frame grabbelen kaart en een solid-state-schijf voor gegevensopslag aanbevolen. Observeren van de afbeelding van de iSCAT op de CMOS-camera en ervoor te zorgen dat er in focus door het vinden van een residuele deeltje van stof of vuil op het glas dekglaasje aan. Controleer of dat het deeltje van beeld is dat een circulair symmetrische punt verspreiden functie (PSF).Opmerking: De belangrijkste reden voor een niet-circulair symmetrische PSF is dat de laserstraal het doel niet in recht maar onder een kleine hoek ten opzichte van de optische as. Dit wordt gecorrigeerd door aanpassing van de hoek en positie van de invallende lichtbundel met de 45° koppeling spiegel. Vergelijk de camerabeelden van het heldere-veld en de fluorescentie-kanalen. Zorg ervoor dat beide in focus zijn en hetzelfde gebied weer te geven. Controleer of de positie van de iSCAT laser ongeveer in het midden van de afbeelding en neem kennis van haar standpunt voor latere referentie. Zie figuur 4b-4f voor typische camerabeelden.Opmerking: Gebruik een cel monster of fluorescerende kralen om de focus van de twee kanalen te vinden. Tijdelijk de fluorescentie long pass filter om aan te passen van het systeem verwijderen. De focus voor conventionele beeldvorming van de cellen moet iets hoger dan het brandvlak van de iSCAT. Om dit te compenseren zonder te verplaatsen van de doelstelling, het verplaatsen van de camera’s van hun posities in de focus van de twee respectieve f = 5 cm lenzen. De nodige camera parameters instellen. Gebruik van een vaste framesnelheid en schakel softwaretools winst en correctie.Opmerking: De volgende parameters worden gebruikt: de iSCAT-camera is ingesteld op 5000 frames per seconde (fps) met een belichtingstijd van 80 µs. Zoals hierboven vermeld, is de grootte van de afbeelding 128 × 128 pixels. Zowel lichte-veld en fluorescentie camera’s werken op volledige framegrootte (1280 × 1024 pixels). Bright-veld imaging is uitgevoerd met een belichtingstijd van 20 ms. De fluorescentie-camera is ingesteld op 750 ms belichtingstijd en 5 opeenvolgende frames worden verzameld om te vormen van één eindbeeld. Bright-veld en fluorescentie afbeeldingen zijn verworven vaste intervallen 20 s tijd. 2. voorbereiding van het Experiment Voorbereiden het medium voorraad microscopie. Voeg 25 mL van de bufferoplossing HEPES (1 mol/L) tot 975 mL van RPMI 1640 medium om een definitieve 1 L 25 HEPES-oplossing van mmol/L. Ook gebruiken een buffer medium met HEPES reeds opgenomen.Opmerking: HEPES wordt gebruikt om de pH-waarde van het medium tijdens een meting in de omgevingsomstandigheden (bijvoorbeeld buiten een incubator en zonder constante aanvoer van CO2 ). Neem een aliquoot deel van de oplossing die nodig zijn voor een experiment en laat het warme tot kamertemperatuur. 2 mL medium is voldoende. Bewaar de resterende voorraad oplossing bij 4 ° C. De Microscoop cuvette voor te bereiden.Opmerking: De volgende stappen beschrijven de procedure voor een op maat gemaakte monsterhouder, bestaande uit een aluminium grondplaat en een acryl cuvette schotel die corrigeert het dekglaasje aan zowel het koppelt aan de piëzo-elektrische 3D positioner. Verkrijgbare steriele cultuur gerechten met een glazen bodem kunnen ook worden gebruikt.Opmerking: Figuur 5 toont foto’s van de op maat gemaakte monsterhouder. Neem een nieuwe microscopie dekglaasje aan en spoel het af met gedeïoniseerd water (DI-water) en ethanol. Lucht drogen de dia met stikstof of perslucht. Reinig het dekglaasje aan in een zuurstof plasma sfeer (0.3 mbar gasdruk) gedurende 10 minuten bij 500 W RF vermogen. Hiermee verwijdert u alle organische verontreinigingen uit het oppervlak. Reinig de acryl cuvette schotel door het onder te dompelen in 0,2 mol/L NaOH oplossing voor ongeveer 10 min. spoelen met DI water. Monteren van de monsterhouder en bedek het met een plastic petrischaal totdat het nodig is in het experiment. Figuur 5: op maat gemaakte monsterhouder. (a) proeven houder onderdelen: (1) acryl cuvette schotel; (2) Aluminium grondplaat; (3) bedrijf schroeven; (4) siliconen O-ring; (5) dekglaasje aan. (b) volledig geassembleerd monsterhouder. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. De Microscoop voor te bereiden. Zet de iSCAT verlichting laser, de heldere-veld/fluorescentie verlichting LED, camera’s en de acquisitie/computersoftware. Het blokkeren van de laserstraal op een positie voor het doel. Zorgen dat de 100 X / 1,46 nb doelstelling is schoon. Als dat niet het geval is, gebruik van lens schoonmaak doekjes en ethanol te reinigen van de doelstelling overeenkomstig de richtsnoeren van de fabrikant. Breng een druppel olie van onderdompeling op de doelstelling van de Microscoop. Neem de monsterhouder (geassembleerd in sectie 2.2) en zorgvuldig monteren op de piezo-fase van de Microscoop iSCAT zodat het monster dekglaasje aan wordt gecentreerd op de doelstelling van de Microscoop. Attente en voorzichtig om niet te beschadigen de objectief zijn. Zet vast de eenheid aan de piëzo-elektrische positioner met duim schroeven terwijl ervoor te zorgen dat de fabrikant opgegeven maximumkoppel niet wordt overschreden. 1 mL van voorraad microscopie medium (bereid in punt 2.1.) in de meetcel toevoegen. Voeg 2 druppels propidium jodide vlek aan het medium als een cel dood marker16,22. Deblokkeren van de laser en brengen het systeem in beeld. Controleer eerst dat de doelstelling is gepositioneerd op de juiste afstand van het dekglaasje aan door stappen 1.2.3 te herhalen. -1.2.5. (Figuur 2). Vervolgens fine-tunen van de focus met de z-as van de piëzo-fase. Controleer of alle instellingen voor de lichtbronnen ter beschikking, camera’s en software correct zijn ingesteld. Het gaat hierbij om parameters zoals laser macht, LED intensiteit, beeldsnelheden voor camera, camera belichtingstijden of software opslaan van paden.Opmerking: Opslaan van video’s op hoge frame rates kan produceren grote bestandsgrootte. Zorgen voor voldoende vrije schijfruimte op de computer. De laserstraal opnieuw blokkeren. De Microscoop is nu klaar voor een experiment. Voorbereiden van de cellen.Opmerking: Laz388 cellen20 worden gekweekt in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), aminozuren, pyruvaat en antibiotica. De cellen zijn worden geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO2 splitsen en voorzien van verse medium elke 2-3 dagen23. Neem de cel cultuur kolf uit de incubator en gecombineerd medium met ongeveer 1 x 106 cellen. Om te bepalen van het juiste volume, de concentratie van de cultuur van de cel te kwantificeren door gebruik van een hemocytometer. Meng de cell oplossing met 10 mL van RPMI 1640 medium bij kamertemperatuur en Centrifugeer het monster bij 300 x g gedurende 7 minuten. Voorzichtig uitpakken en verwijder het supernatant en tegelijkertijd te garanderen dat de pellet van geconcentreerde cellen ongestoord blijft. Herhaal stap 2.4.2. -2.4.3. met de geconcentreerde pellet van cellen. Resuspendeer de cellen in 0,5 mL voorraad microscopie medium (bereid in punt 2.1.) en ze direct te gebruiken in een experiment. 3. iSCAT microscopie van afscheidende cellen Ervoor zorgen dat de laserstraal is geblokkeerd om te voorkomen dat de cellen worden rechtstreeks blootgesteld aan het licht van de laser iSCAT. Het injecteren van de cellen in het monster cuvette. Injecteren ongeveer 3 µL van het cel monster (bereid in sectie 2.4.) iets uit het midden in de steekproef cuvette. Zachtjes aanraken van het uiteinde van de pipet om het dekglaasje aan en langzaam de cel oplossing te injecteren. De cellen te vestigen op het dekglaasje aan toestaan.Opmerking: Gebruik kleine volume pipet tips (10 µL) of lange, flexibele gel-laden-tips. Zorg ervoor dat de dichtheid van de cellen onder ongeveer 1 cel per 500 µm² zodat eencellige metingen worden niet beïnvloed door meerdere cellen in het gebied rond de iSCAT laser. Als het aantal cellen te laag, herhaal stap 3.2.1 is. totdat er een voldoende aantal beschikbaar is. Als het bereik van cellen te dichte, gebruikt u een injectie van ongeveer 20 µL van extra microscopie medium te verspreiden van de cellen in het dekglaasje aan. Met de piezo-positioner, verplaatsen het monster lateraal om de positie van een cel dicht (ongeveer 10 µm) aan het gezichtsveld van iSCAT. Zorg ervoor dat de cel niet in het gezichtsveld van iSCAT zoals de rechtstreekse blootstelling aan de 445 nm laserlicht schadelijk voor de cel zijn kan. Helder-veld en fluorescentie afbeeldingen gebruiken om te zoeken en controleren van de levensvatbaarheid van de cel25.Opmerking: Een levensvatbare cellen heeft een ronde vorm in het beeld helder-veld en is niet tl, overwegende dat de dood van de cel wordt aangegeven door sterke fluorescentie signalen die voortvloeien uit de aanwezigheid van propidium jodide binnen de cel22. Deblokkeren van de laserstraal iSCAT en ervoor te zorgen dat het dekglaasje aan oppervlak nog steeds in beeld is. Omsluiten de isolatie-tabel om te minimaliseren van de drift en akoestische koppeling van de omringende omgeving.Opmerking: De laatste wordt bereikt met zware optische gordijnen of acryl panelen rondom de optische tabel. Start de meting door afbeeldingen ophalen van camera’s van de iSCAT, helder-veld en fluorescentie. Automatiseren en controle over het proces door middel van software om experimentele productiviteit te maximaliseren. Controleert regelmatig de levensvatbaarheid van de cel en de focus van het systeem.Opmerking: Afhankelijk van de intensiteit van de laser, optische componenten en tijdinstellingen van de blootstelling van de camera, de iSCAT laser kan interfereren met de fluorescentie-camera. Dit probleem wordt waargenomen, overweeg de iSCAT laser bekisting tijdelijk tijdens fluorescentie afbeelding acquisities. 4. de gegevensanalyse Opmerking: Experimentele gegevens is inherent luidruchtige en iSCAT beelden zijn niet anders. Er zijn verschillende bronnen van lawaai in een typische iSCAT meting, met inbegrip van wavefront verstoringen in de invallende lichtbron, de oppervlakteruwheid van de dekglaasje aan, en het lawaai van de camera. De sectie hieronder presenteert enkele manieren waarop deze lawaaibronnen worden verholpen via de nabewerking. Bovendien, laterale mechanische instabiliteit van de instellingen leiden tot luidruchtige gegevens en dienovereenkomstig, zoals beschreven in de sectie discussie hieronder moeten worden aangepakt. De beschreven analyses worden uitgevoerd met aangepaste scripts van MATLAB. Minimaliseren camera lawaai door de ruwe gegevens filteren met een twee-dimensionale Fourier-filter dat hoge ruimtelijke frequenties uitsluit. De grootte van het filter moet worden aangepast aan de specifieke experimentele configuratie (meestal bepaald door de numerieke diafragma van het systeem).Opmerking: Functies in de afbeelding met een hogere ruimtelijke frequenties dan het optische systeem zijn afkomstig uit andere bronnen (zoals camera uitlezing lawaai) en kunnen worden verwaarloosd. Omzetten in de beelden van de graven van de camera raw iSCAT contrast.Opmerking: Het signaal gedetecteerd door de camera is . iSCAT contrast wordt gedefinieerd als waar is de intensiteit van het licht van de verwijzing, in dit geval het deel tot uiting door het dekglaasje aan, en is de interferentie tussen en de verspreide intensiteit (). Scheiden van het signaal in en door het berekenen van het temporele gemiddelde van bepaalde frames waarin de deeltjes van belang niet aanwezig zijn. Het resulterende beeld biedt de verwijzing signaal .Opmerking: Als alternatief, een actieve achtergrond aftrekken stap kan worden uitgevoerd zoals beschreven in de discussie hieronder. Berekenen van contrast volgens 12,14,16. Maak een rollende differentiële afbeelding door af te trekken elke opeenvolgende frame van zijn opvolger.Opmerking: Resterende signalen van de oppervlakteruwheid van het dekglaasje aan en wavefront verstoringen effectief in deze stap worden verwijderd als ze constant binnen opeenvolgende frames zijn. Het glooiende differentieel verwijdert deze resterende signalen, waardoor alleen het eiwit bindingen die van het ene frame naar het volgende optreden. Deze dynamische achtergrond aftrekken is gunstig als het is niet gevoelig voor lange termijn monster driften. Toepassing van een algoritme piek-zoekende om detecteren en indexeren van enkele deeltjes voor elk frame en hun specifieke contrast en positie te bepalen. In stap 4.4 verzamelde informatie gebruiken voor het maken van histogrammen van eiwit bindende evenementen en hebben betrekking op hun uitgepakte contrasten eiwit massa door middel van een ijkcurve die is samengesteld uit bekende eiwit monsters14,24.

Representative Results

Een schematische voorstelling van een Microscoop iSCAT is afgebeeld in figuur 4a. Representatieve helder-veld, fluorescentie en rauwe iSCAT afbeeldingen worden weergegeven in figuur 4b, 4 cen 4 d, respectievelijk16. Figuur 4e en 4f tonen de resultaten van de achtergrond verwijderen en differentiële nabewerking; twee geadsorbeerde eiwitten zijn zichtbaar als diffractie-beperkte plekken in 4f van de figuur. Figuur 6 toont een histogram van de gedetecteerde eiwitten in de loop van de 125 s. Deze gegevens werden verkregen door toepassing van een algoritme piek-zoekende naar de opnames om te tellen de bindende gebeurtenissen en hun contrast16winkel. Een totaal van 503 eiwitten werden ontdekt. Volgende, secreted soorten zijn geïdentificeerd ten opzichte van de referentiemetingen uitgevoerd op gezuiverde eiwit oplossingen, of via aanvullende metingen met matiemaatschappij glazen oppervlakken14,16. De iSCAT gegevens, dus visualiseren direct cellulaire secretie dynamiek op een subsecond schaal16. Als voorbeeld, hebben we eerder geconstateerd dat IgG antilichamen een belangrijke fractie van de Laz388 secretome zijn en zijn vrijgelaten uit de cel met een snelheid van ca. 100 moleculen per tweede16. Daarnaast worden andere deeltjes die verspreid over een bereik van 100 kDa – 1000 kDa uitgescheiden door de cellen16. De beschreven methode kunnen verder werknemer bijvoorbeeld te onderzoeken van de ruimtelijke gradiënt van de concentratie van afscheidingen rond een cel16, of om te bepalen van de temporele dynamiek van cellulaire lysis16. Figuur 6: kwantificering van secreted eiwitten door een eencellige Laz388. Het histogram geeft gedetecteerde eiwitten in een periode van 125 s. Contrast waarden worden verzameld in 1 x 10-4 contrast bakken (blauwe staven). Een totaal van 503 individuele eiwitten werden geteld tijdens deze meting. Het experiment werd 10 keer herhaald met vergelijkbare resultaten. Dit percentage is aangepast van McDonald, M.P. et al. 16. copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Een van de meest cruciale aspecten voor het verkrijgen van nuttige iSCAT gegevens is de mogelijkheid om het vinden van de juiste focal positie op het dekglaasje aan oppervlak, en, bovendien, houd deze positie voor langere tijd. Niet te doen zal resulteren in de verruimde spinnen bestemde, zwakke iSCAT signalen en drift-geassocieerde artefacten in dynamics analyses. Het blijkt dat het brandvlak vinden op een dekglaasje schoon, kaal aan oppervlak niet een gemakkelijke taak is als oppervlaktekenmerken niet zichtbaar tegen de achtergrond van de lichtbundel grote referentie zijn (Zie Figuur 4 d).

Rauwe iSCAT beelden zijn vaak verduisterd door achtergrond signalen die voortvloeien uit de wavefront onzuiverheden in de bron excitatie en iemands vermogen om te vinden van de juiste beeldvorming vliegtuig kunnen belemmeren. Actieve wavefront aftrekken is een handige manier om dit probleem te omzeilen en vervolgens controleren de iSCAT focus tijdens een meting¹⁶. Een manier om dit te bereiken is via ruimtelijke monster modulatie. Kortom, geldt een functiegenerator een blokgolf 50 Hz voor de poort van de externe controle van de piëzo-fase, wat resulteert in een ruimtelijke monster modulatie op de toegepaste frequentie (290 nm amplitude). Synchrone camera overnames worden getriggerd uit dezelfde bron, en combinatie door lock-in principes, leiden tot een wavefront-gecompenseerd afbeelding¹⁴^,¹⁶. De resulterende afbeelding toont meestal de oppervlakteruwheid van het dekglaasje aan (figuur 4e). Kleine elementen na reiniging kan worden gebruikt om de Microscoop in focus nog op het glas. Parameters die worden gebruikt voor deze actieve achtergrond aftrekken stap kunnen worden gewijzigd volgens de framesnelheid, belichtingstijd of hardware.

Zoals hierboven vermeld, het gebruik van een hoge kwaliteit balk splitter in het iSCAT-setup (stap 1.2.1.) wordt aanbevolen, als artefacten zoals beeldschaduwen imaging of interferentie als gevolg van dunne vlakke beam splitters zal beïnvloeden het beeld en de meting verstoren. Figure 7 toont een vergelijking tussen een hoge kwaliteit en lage kwaliteit balk splitter. Beide raw iSCAT beelden tonen hetzelfde gebied op het dekglaasje aan met sommige overblijvende deeltjes. De zelfde iSCAT setup werd gebruikt om beide beelden te vangen, alleen de balk splitter werd uitgewisseld. Figuur 7a toont het beeld gevormd op de camera door het gebruik van een dikkere (5 mm), AR-coating, en steken balk splitter. Wegens de steken opzet, de weerkaatste lichtbundel van het achterste oppervlak van de balk splitter is anti-parallel aan de reflectie die voortvloeien uit de voorzijde en is het niet invoeren van de doelstelling. Geen inmenging artefacten optreden. Figuur 7b toont het hetzelfde gezichtsveld op monster, maar ditmaal een dunner (1 mm) vlakke balk splitter is gebruikt. De twee reflecties van de oppervlakken van voor- en achterkant van de balk splitter zijn parallelle en doorgeven aan de camera. Interferentie artefacten zijn duidelijk zichtbaar.

Figuur 7: vergelijking van iSCAT beelden geproduceerd met behulp van hoge – en lage-kwaliteit beam splitters. (a) afbeelding van de rauwe iSCAT Resulting door gebruik van een 5 mm dikke AR-coating en steken balk splitter. (b) Resulting rauwe iSCAT afbeelding van hetzelfde gebied door gebruik van een 1 mm dikke vlakke balk splitter. Beide beam splitters hebben dezelfde verdelende verhouding (50% reflectie, 50% overdracht). Interferentie artefacten die voortvloeien uit de reflecties van de Fresnel duidelijk in acht worden genomen in de afbeelding dat is geproduceerd met de 1 mm dik vlakke balk splitter. Schaal bars: 2 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

In dit protocol beschrijven we een regeling van de verlichting van het breed-gebied voor iSCAT zoals het is snel, eenvoudig te realiseren en zorgt voor parallelle sensing over een groot gebied¹⁴. Een andere gemeenschappelijke benadering is het gebruik van akoestisch-optische leidschoepen (gedelegeerd) en het scannen van een confocal balk over de monster¹²^,¹⁷. Deze aanpak voorkomt de noodzaak van kwalitatief hoogstaande wavefronts maar is meer experimenteel complex dan conventionele beeldvorming van het breed-gebied. Bovendien wordt de snelheid van de confocal verlichtingssterkte beperkt door die van gedelegeerd. Afhankelijk van de gewenste experimentele parameters, kunnen, beide regelingen confocal of breed-gebied verlichting in principe, worden gebruikt om detecteren één eiwitten afgescheiden van levende cellen.

Zoals besproken in het gehele protocol, is het noodzakelijk om te minimaliseren van de laterale mechanische schommelingen in de fase van het monster van de Microscoop. Zelfs nanometer afwijkingen in de positie van het monster kunnen leiden tot variaties in opeenvolgende camera frames en veroorzaken aanzienlijke omgevingsgeluid in de differentiële afbeelding. Daarom wordt aangeraden om een mechanisch stabiel Microscoop-fase en een gedempte optische tabel (stap 1.1.1.) te gebruiken en ter dekking van de installatie met optische gordijnen of panelen tijdens een experiment (stap 3.5.).

Een actieve focus stabilisatie regeling kan ook worden overwogen voor de lange termijn metingen. In deze aanpak, is een tweede laser in een totale interne reflectie (TIR) regeling opgenomen in de Microscoop en vervolgens beeld op een fotodiode Kwadrant. Wijzigingen in het systeem focus vertalen naar laterale verplaatsingen van de plek op de Kwadrant diode, die vervolgens kan worden gebruikt in een actieve terugkoppeling te controleren van de z-as van de piezo fase²⁶TIR-laser. Langetermijneffecten van de verticale drift worden dus geëlimineerd.

Verschillende wijzigingen en uitbreidingen kunnen worden toegepast op de gepresenteerde techniek om specifieke experimentele behoeften. Commerciële Microscoop fase incubators zijn bijvoorbeeld beschikbaar die gemakkelijk in de Microscoop iSCAT voor langdurige beeldvorming van cellen kunnen worden opgenomen. Andere technieken kunnen ook worden uitgevoerd als aanvulling op iSCAT imaging, zoals confocal of TIR fluorescentie microscopies¹⁷. Aan te passen op het systeem onder studie, iSCAT secretie metingen kunnen worden verricht in een andere cel media zoals DMEM of DPBS, echter moet de pH-indicator fenol-rode worden vermeden aangezien het het experiment als gevolg van de absorptie van het laserlicht kan verstoren. Bovendien bevatten de supplementen zoals foetaal kalfsserum (FCS) of menselijke bloedplaatjes lysate (hPL) eiwitten die met de detectie van de iSCAT interfereren kunnen. Afhankelijk van de gewenste gevoeligheid van het experiment, dienen deze supplementen worden uitgesloten van de microscopie medium.

iSCAT afhankelijk van een analyt scatter licht kunnen — een eigenschap die inherent is aan alle eiwitten — en dus inherent niet-specifieke. Niettemin, is een zekere mate van specificiteit kan als iSCAT signalen schaal lineair met eiwit massa¹⁴^,²⁷^,²⁸. Dit zorgt voor de kalibratie van een systeem van de iSCAT met behulp van standaard EiwitSteekproeven, zoals bovien serumalbumine (BSA) en fibrinogeen¹⁴^,²⁷^,²⁸. In feite, zeer onlangs, jonge et al. ²⁸ hebben uitgebreid over het werk van Piliarik & Sandoghdar¹⁴ en hebben aangetoond dat iSCAT kan worden gebruikt voor het bepalen van het molecuulgewicht van eiwitten zo klein als daar (53 kDa) met een massa resolutie van 19 kDa en een nauwkeurigheid van ongeveer 5 kDa. Verschillende conventionele benaderingen kunnen iSCAT verder aanvullen door middel van een extra niveau van specificiteit. Als een voorbeeld, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), en/of andere oppervlakte wijzigingen, eiwit bindende gebeurtenissen zodanig beperken dat alleen het doel eiwit gedetecteerde^{16 is}.

In dit protocol beschreven we hoe iSCAT microscopie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van cellulaire afscheidingen op het niveau van één eiwit met subsecond temporele resolutie¹⁶. De techniek is algemeen en op alle commerciële of huis-gebouwde Microscoop kan worden uitgevoerd. In tegenstelling tot één-molecuul fluorescentie benaderingen, de methode geen last van photobleaching of knipperen effecten, maar het nog steeds behaalt single-eiwit gevoeligheid. Deze eigenschappen maken iSCAT een krachtig instrument op het gebied van biosensing en microscopie. Toekomstige toepassingen zal zich richten op het ophelderen van complexe cellulaire interacties zoals immunologische reactie op een stimulus of cellulaire communicatie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door het Max-Planck-Gesellschaft, een hoogleraarschap aan Alexander-von-Humboldt, en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Wij danken Stefanie Schaffer in Universitätsklinikum Erlangen, voor het verstrekken van Laz388 cellen en voor nuttige discussies. Wij danken Simone Ihloff en Maksim Schwab op MPL voor technische ondersteuning.

Materials

Item/Device
100x / 1.46 NA objective	Zeiss	420792-9800-000	alpha Plan Apochromat oil immersion
20x / 0.4 NA objective	Leica	566049	N Plan
Piezo Stage	PI	P-517k020	3-axis stage with 100x100x10µm range
Diode laser (445 nm)	Lasertack	PD-01236
Optics/Optomechanics	Thorlabs/Newport	–	lenses, mirrors, posts, mounts
Pinhole	Thorlabs	P30H
LED light source	Thorlabs	MCWHL5
Shortpass filter (580 nm)	Omega Optical	580SP	to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
Longpass filter (500 nm)	Thorlabs	FEL0500	to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
70R/30T beam splitter	Newport	20Q20BS.1
Economy beam splitter	Thorlabs	EBS1	used for the comparison of fringe effects
Wedged plate beam splitter	Thorlabs	BSW26	used for the comparison of fringe effects
Shortpass dichroic mirror (550 nm)	Edmund Optics	66249
8R/92T beam splitter	Thorlabs	BP108
CMOS camera	Photonfocus	MV1-D1024E-160-CL	for iSCAT aquisition
CMOS cameras	Mightex	SCE-B013-U	for bright field / fluorescence aquisition
Longpass filter (600 nm)	Thorlabs	FELH0600
Computer	Fujitsu Siemens	–	Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD
Acquisition Software	LabVIEW	–	LabVIEW 2016 Suite
Analysis Software	Matlab	–	Matlab 2014 Suite
Plasma Cleaner	Diener	Diener pico
Incubator	Binder	Model CB
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Reagent/Material
RPMI 1640 medium	Gibco	11835063	without phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Sigma Aldrich	59205C
Cover slides	Marienfeld	107052
Glass bottom culture dishes	ibidi	81158
Fluorescent Microspheres	Invitrogen	F8821	used for calibration
Immersol immersion oil	Zeiss	444960
Propidium iodide stain	Invitrogen	R37108
Small pipette tips	Eppendorf	30075005
Flexible pipette tips	Eppendorf	5242956003
Ethanol, 99.8%	Fisher Scientific	E/0650DF/15
Sodium hydroxide, pellets	Sigma Aldrich	221465	for preparing 0.2M NaOH solution

References

Hathout, Y. Approaches to the study of the cell secretome. Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).
Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).
Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).
Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).
MacBeath, G. Protein microarrays and proteomics. Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).
Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).
Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. Optical biosensors. Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).
Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity. Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).
Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod. Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).
Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images. eLife. 6, e25648 (2017).
Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy. Physical Review Letters. 93 (3), 037401 (2004).
Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface. Optics Express. 14 (1), 405 (2006).
Piliarik, M., Sandoghdar, V. Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites. Nature Communications. 5, 4495 (2014).
Roux, K. H. Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy. International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).
McDonald, M. P., et al. Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity. Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).
Kukura, P., Ewers, H., Müller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus. Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).
Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
Spindler, S., et al. Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002 (2016).
Lazarus, H., et al. Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic ("null" cell) leukemia. Cancer Research. 38 (5), 1362-1367 (1978).
Mackensen, A., et al. Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma. Cancer Research. 53 (15), 3569-3573 (1993).
Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).
Freshney, R. I. Primary Culture. Culture of Animal Cells. , (2005).
Dahmardeh, M., et al. . Unpublished data. , (2018).
Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).
Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy. Biophysical Journal. 106 (2), 606a (2014).
Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins. Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).
Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Gemeinhardt, A., McDonald, M. P., König, K., Aigner, M., Mackensen, A., Sandoghdar, V. Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58486, doi:10.3791/58486 (2018).

Automatically Generated