خالية من تسمية "التصوير من واحد البروتينات ويفرز" من "الخلايا الحية" عبر إيست المجهري

تنبيه: يرجى قراءة جميع صحائف بيانات سلامة المواد (MSDS) قبل استخدام أي مواد كيميائية ومراقبة جميع ممارسات السلامة المناسبة، وارتداء معدات الوقاية الشخصية (نظارات واقية الليزر، حماية العين، القفازات، ومعاطف المختبرات) حسب الحاجة. 1-بناء إيست المجهر16،18 ملاحظة: المجهر إيست يتكون عادة من إعداد تعديل المجهر المقلوب. وباختصار، ليزر وتركز على المستوى البؤري مرة أخرى من هدف الفتحة العددية عالية (غ) ويستخدم عدسة تصوير إلى التركيز الجسيمات المنتشرة في الظهر الضوء على رقاقة كاميرا. بشكل عام، يمكن بناؤها من الصفر هذا المجهر واسع المجال أو استناداً مجهر مقلوب موجود. ويغطي هذا البروتوكول خطوات ضرورية لتحقيق الإعداد، بينما التغييرات في الأجهزة المستخدمة الممكنة. ويمكن الاطلاع على وصف أكثر تفصيلاً للجمعية المجهر إيست في أعمال أرويو et al. 18. تنبيه: ينطوي مجهر إيسكات IIIB فئة “الفئة الرابعة” الليزر مصدر الضوء. من الضروري حماية العين المناسبة عند تجميع ومحاذاة البصريات المجهر. أثناء الجمعية العامة المجهر، تأكد من أن مسار شعاع الليزر ويظل مستقيم وهو لا نحيد كما تتم إضافة مكونات بصرية جديدة. قم بإعداد مسار إضاءة المجهر. استخدام جدول ضوئية ثبط وكتلة معدنية صلبة، بناء مجهر عينة مرحلة18 يتضمن هدفا فتحه عددية عالية (غ) (100 X/1.46 غ) ووحدة لترجمة التي تسمح لترجمة نموذج الأفقي، فضلا عن تغيير في التركيز الموقف لتحقيق الهدف.ملاحظة: تشغيل المجهر إيست في الحد الأقصى لكشف البروتينات وحيدة عرضه للاهتزازات الخارجية. ينصح مرحلة بيزو سينتروسيميتريك الذي يعتمد العينة من جميع الجوانب للحد من الجسيمات الصوتية من العينة التي وإلا يعرض للخطر الاستقرار المركزية والجانبية. ويبين الشكل 1 مرحلة عينة مناسبة، بما في ذلك وحدة الترجمة بيزو والهدف. وبالإضافة إلى ذلك، من المستحسن أن تستخدم يتصاعد ضخمة ومستقرة لجميع المكونات البصرية التي تمت مناقشتها في الخطوات التالية. هذه المكونات متاحة بسهولة من الموردين البصريات التجارية. استخدام عدسة القميص البعد البؤري 50 سم (عدسة واسع المجال) و 45° (عمودي) اقتران مرآة للتركيز على ضوء ليزر صمام ثنائي في الطول الموجي 445 شمال البحر الأبيض المتوسط على المستوى البؤري العودة من الهدف. وهذا يخلق شعاع وتحديدالمنطقه في التركيز الهدف إلى الأمام، وسوف تصبح مصدر الإضاءة إيست. إذا لزم الأمر، قم بتصفية الليزر مكانياً قبل العدسة 50 سم عن طريق 30 ميكرومتر الثقب أو الألياف وضع واحد. تطبيق معالجة تجميعية للنفط الغمر بالهدف ومكان ساترة زجاجية في الطائرة عينة من مرحلة مجهر. وهذا سيؤدي إلى شعاع يعكس التراجع عن طريق التصوير والهدف.ملاحظة: الانعكاس ينبع من الواجهة الزجاجية الهواء على السطح العلوي ساترة عينة وسيكون بمثابة الأساس لشعاع المرجع إيسكات. المتبقية من التراب أو الغبار على سطح ساترة ستؤدي إلى تشتت المصادر، التي تساعد في التركيز الصحيح لهدف التصوير في الخطوات التالية.تنبيه: معظم ضوء الليزر ينقل عن طريق ساترة ويسافر مباشرة أعلى من الهدف. ضع الناشر براق كامد (مثلاً.، بطاقة ورق) أعلاه ساترة للتقليل من خطر الإصابة من ضوء الليزر. رقم 1: مرحلة عينة إيست- تظهر الصورة كتلة الألومنيوم الواسعة النطاق التي شنت وحدة الترجمة بيزو (أسود) فضلا عن 100 توسيط × الهدف. المرحلة 3-محور بيزو يسمح لتحديد المواقع بدقة العينة في المستوى البؤري للهدف. تركز الخشنة ينفذ عن طريق تناوب أنبوب خيوط التي شنت الهدف (لا يصور). يتم وضع بلوك على الطاولة الضوئية مع أربع ركائز الصلب أعلاه مرآة اقتران 45°. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- قم بإعداد مسار التصوير من المجهر. يعرض أنتيريفليكشن (ع)-مغلفة بشعاع الخائن (انعكاس 70%، وانتقال 30%) بزاوية 45 درجة بالنسبة لشعاع الحادث، وما يقرب من 10 سم بعد العدسة واسع المجال. نقطة طلاء ع صوب مصدر الليزر. هذا ينقل شعاع الحادث، ويعكس الإشارة ومتناثرة الشعاع بزاوية 90 درجة لشعاع الحادث.ملاحظة: ينصح شق الحزم المغلفة AR و/أو مثبتة كما يمكن أن تحدث تأثيرات الظلال وهامش كبير عند استخدام شعاع تقسيم المكعبات، أو شق شعاع مستو غير المصقول. انظر المناقشة للحصول على المزيد من التفاصيل. إذا رغبت في ذلك، قد يتم حظر أي شعاع ينعكس غير المرغوب فيها ناشئة عن الجانب الخلفي من التقسيم شعاع باستخدام الأغشية آيريس. سوف يعرض الخائن شعاع سميكة تشريد شعاع كبير حيث أن الليزر قد لا يدخل الهدف مباشرة بعد الآن. إذا لزم الأمر، إعادة توجيه مسار شعاع الليزر قبل التقسيم شعاع لضمان نشر الصحيح من خلال الهدف.ملاحظة: قد أيضا إضافة التقسيم شعاع قبل العدسة ميدانية واسعة ومرحلة مجهر يتوضع (في الخطوة 1.1.2.)، حيث أنه سوف لا يكون المشردين الشعاع لاحقاً. عند هذه النقطة، تركز ذراع السابر التصوير والتأكد من أن نموذج الطائرة وكاميرا بارفوكال. ضع f مقعرة = عدسة-45 سم في موقف 5 سم بعد العدسة واسع المجال في مسار الشعاع الحادث. وهذا سيؤدي إلى شعاع وتحديدالمنطقه دخول الفتحة الخلفية للهدف. مع شاشة موضوعة في ذراع ينعكس السابر، نقل الهدف في الاتجاه العمودي للعثور على موضع تركيز الخشنة. والهدف في التركيز عند شعاع ضرب الشاشة وتحديدالمنطقه.ملاحظة: يبين الشكل 2 تخطيطي لهذه العملية. إزالة كلا f =-45 سم العدسة والشاشة عند اكتمال تركز الخشنة.ملاحظة: بدلاً من استخدام عدسة البعد البؤري سالبة، واسع المجال العدسة نفسها قد تكون وضعت على جبل منقولة وتحولت خارج مسار الشعاع لهذه الخطوة. ومع ذلك، من المستحسن لتحقيق التكوين المجهر الأكثر استقرارا، عقد العدسة واسع المجال في وضع ثابت. أضف و ثاني = 50 سم القميص عدسة لتركيز الضوء المتناثرة وكلمات الضوء المنعكس على جهاز الاستشعار لكاميرا CMOS. ضمان وضع العدسة 50 سم من الطائرة التنسيق مرة أخرى الهدف بغية إعادة كلمات شعاع الإشارة والتركيز على ضوء متناثرة. مكان المكمل رقاقة 50 سم بعيداً عن f = عدسة 50 سم وموقف الحزم مباشرة على منتصف الرقاقة.ملاحظة: يتم عادة استخدام المعلمات التالية للتصوير. إنتاج الطاقة من الليزر (الطول الموجي 445 نيوتن متر) يتم تعيين إلى 100 ميغاواط. الثقب وشعاع الخائن تخفف الضوء المنقولة حيث أن قوة فعالة دخول الهدف هو حوالي 9 ميغاواط. ويبلغ قطر شعاع الموضع عينة 6 ميكرومتر. مع عدسة التصوير المستخدمة، والتكبير الفعال للنظام هو العاشر حوالي 300. يتم تعيين حجم الصورة على رقاقة CMOS إلى 128 × 128 بكسل داخل المنطقة المضاءة، أسفر عن مجال رؤية لحوالي 5 × 5 ميكرومتر2. ويبين الشكل 3 تخطيطي المجهر إيست مجمع بشكل كامل. رقم 2: تركز الخشنة المجهر إيسكات. التخطيطي يظهر هذا الترتيب للبصريات للمساعدة في إحلال النظام في التركيز. الجانب الخلفي من المقسم والحزم المغلفة AR (70/30 درجة البكالوريوس) يتسم باللون الأحمر. يتم توفير مسافات هامة باللون الأخضر. تتم الإشارة إلى الأطوال (f) من العدسات المستخدمة. يتم إضافة المكونات في مربع أزرق متقطع في الخطوات 1.2.6-1.2.7. تتم إزالة العدسة مقعرة (يستخدم لإعادة كلمات شعاع إيست المتقاربة) والشاشة في وقت لاحق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3: مجهر إيسكات. التخطيطي يظهر المجهر إيست مجمع بشكل كامل. الجانب الخلفي من المقسم والحزم المغلفة AR (70/30 درجة البكالوريوس) يتسم باللون الأحمر. يتم توفير مسافات هامة باللون الأخضر. تتم الإشارة إلى الأطوال (f) من العدسات المستخدمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- إعداد قنوات إضافية بالتصوير.ملاحظة: هذا المقطع إضافة مسار التصوير آخر للمجهر الذي يسمح للمراقبة لمساحة كبيرة تحيط بالليزر إيست عن طريق الفحص المجهري مشرق الميدان، ورصد سلامة الخلية عن طريق الفحص المجهري الأسفار. زوجين الناتج من مصدر ضوء LED (حوالي 500 نانومتر < λ < 580 نانومتر) إلى فترة طويلة تعمل مسافة 20 ×/0.4 غ الهدف، وتثبيت المكونات الميكانيكية أعلاه قاعة العينة التي تسمح للتركيز والموضع الأفقي لإخراج الصمام على عينة. التأكد من أن الصمام إخراج الطيف ويغطي نطاق الإثارة علامة موت الخلية (يوديد propidium (PI)) ولا يتدخل في الأسفار (λ > 600 nm). استخدام المرشحات الضوئية إذا لزم الأمر. نقل الهدف العلوي أفقياً بحيث العلوي (واسع المجال) والسفلي (إيست) الأهداف التي تربطها علاقة خطية متداخلة. يتم تحديد هذا بواسطة وضع شاشة في إطار الهدف الأدنى وزيادة كثافة الضوء LED المنقولة على الشاشة. ضع λ = قصيرة-تمرير نانومتر 550 مرآة مزدوج اللون (المناول) لتقسيم المنقولة الصمام الخفيفة عن طريق الليزر إيسكات. تقسيم هذا الشعاع إلى اثنين من القنوات مع تقسيم شعاع النقل reflective/92% 8% (درجة البكالوريوس). المسار 92% القناة الأسفار وهو استخدام المسار 8% لتصوير مشرق الميدانية. صورة القناة مشرق الميدان على كاميرا CMOS باستخدام واو = 5 سم يبنوا متعامي العدسة. صورة القناة الأسفار على كاميرا CMOS منفصلة باستخدام واو = 5 سم يبنوا متعامي عدسة و λ = 600 نانومتر طويلة تمرير مرشح لحجب ضوء الإثارة. ويبين الشكل 4a تخطيطي المجهر مجمع بشكل كامل بما في ذلك جميع القنوات التصوير. الشكل 4: الفحص المجهري إيست للبروتينات التي تفرزها الخلايا المفردة. (أ) التخطيطي المجهر المبينة في البروتوكول. انظر القسم 1 لمزيد من المعلومات. المختصرات: الصمام، أدى؛ منتدى جنوب المحيط الهادئ، مرشح تمرير قصيرة؛ obj، الهدف؛ المناول، قصيرة-تمرير مرآة مزدوج اللون؛ بكالوريوس، شعاع الخائن؛ قائمة بيم فورتين, مرشح تمرير منذ فترة طويلة؛ فرنك بلجيكي، مشرق الميدانية؛ فلور، الأسفار؛ C1-C3، كاميرا 1-3. (ب) برايت-حقل صورة واحدة Laz388 خلية حوالي 4 ميكرومتر بعيداً عن مجال الرؤية إيست (يصور بمربع أبيض). صورة اتخذتها كاميرا C3، شريط الحجم: 10 ميكرون. (ج) الأسفار صورة نفس المنطقة المبين في الفقرة (ب) مع موضع الخلية تميزت بدائرة بيضاء. نظراً لغياب fluorescence يشير إلى أن الخلية قادرة على البقاء. صورة اتخذتها كاميرا C2، شريط الحجم: 10 ميكرون. (د) إيست خام الكاميرا صورة اللقطة مع وقت التعرض المايكروثانيه 80. صورة اتخذتها كاميرا C1. (ه) صورة إيست من نفس المنطقة بعد الطرح الخلفية الزمانية المكانية كما هو موضح في جزء المناقشة. الصورة كانت المتكاملة على مدى 1000 متسلسلة الخام الإطارات (د) مع وقت إطار نهائي 400 مللي ثانية، ويكشف عن خشونة السطح من ساترة زجاجية. (و) المناظرة التفاضلية إيست الصورة التي توضح الحدث الملزم من البروتينات 2 على ساترة. الصورة شيد بطرح اثنين من الصور التي تمت تصفيتها على التوالي (ه). تغيير حجم أشرطة في (د)، (ه) و (و): 1 ميكرومتر. وهذا الرقم قد تم تكييفه من ماكدونالد، عضو البرلمان وآخرون 16-الجمعية الكيميائية الأمريكية 2018 حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- قم بإعداد الكمبيوتر والبرمجيات. قم بتوصيل جميع الكاميرات على جهاز كمبيوتر. تثبيت حزم برامج التشغيل الخاصة بكل منها، والحصول على وكتابة البرامج لسيطرتها.ملاحظة: الأجهزة المناسبة أمر ضروري للمقتنيات عالية السرعة. كحد أدنى، ينصح معالج متعدد النوى، 16 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي وبطاقة المختطف إطار وقرص الحالة الصلبة لتخزين البيانات. مراقبة الصورة إيست على كاميرا CMOS والتأكد من أنها في التركيز بالبحث عن جسيمات الغبار أو الاوساخ متبقية على ساترة زجاجية. تأكد من أن الصورة الجسيمات نقطة دائري متماثل نشر الدالة (PSF).ملاحظة: السبب الرئيسي في PSF غير دائري متماثل أن شعاع الليزر لا يدخل الهدف مباشرة ولكن بزاوية صغيرة فيما يتعلق بالمحور البصري. يتم تصحيح هذا عن طريق ضبط زاوية والموقف من شعاع الحادث مع مرآة اقتران 45°. قارن بين صور الكاميرا مجال المشرق والقنوات الأسفار. ضمان أن كلاهما في التركيز وعرض نفس المنطقة. تحقق من أن موقف الليزر إيسكات تقريبا في وسط الصورة والإحاطة علما بموقفها كمرجع لاحق. انظر الشكل 4 باء – 4f لصور الكاميرا نموذجي.ملاحظة: استخدم عينة خلية أو الخرز الفلورسنت للعثور على تركيز القناتين. مؤقت إزالة عامل التصفية منذ فترة طويلة-تمرير الأسفار لضبط النظام. يجب أن يكون أعلى بقليل من المستوى البؤري إيست التركيز للتصوير التقليدي للخلايا. وللتعويض عن ذلك دون نقل الهدف، تحل محل الكاميرات من مراكزها في تركيز و كل اثنين = العدسات 5 سم. تعيين المعلمات الكاميرا اللازمة. استخدم معدل إطار ثابت وتعطيل أدوات الكسب وتصحيح البرامج.ملاحظة: يتم استخدام المعلمات التالية: تم تعيين الكاميرا إيست إلى 5000 من الإطارات في الثانية (fps) مع وقت تعرض المايكروثانيه 80. وكما ذكر أعلاه، حجم الصورة 128 × 128 بكسل. تعمل الكاميرات مشرق الميدان والأسفار في حجم الإطار الكامل (1280 × 1024 بكسل). يجري تصوير برايت-الحقل مع وقت تعرض 20 مللي ثانية. يتم تعيين الكاميرا الأسفار إلى وقت التعرض 750 مللي ثانية، وتراكمت 5 إطارات متتالية لتشكيل الصورة النهائية واحدة. يتم الحصول على صور ساطعة-الحقل والأسفار في فترات زمنية ثابتة في ق 20. 2-التحضير للتجربة تحضير المتوسط مجهرية الأسهم. إضافة 25 مل من “محلول المخزن المؤقت حبيس” (1 مول/لتر) لمل 975 من المتوسط RPMI 1640 للحصول على ل 1 نهائي من 25 mmol/لتر حبيس الحل. بدلاً من ذلك، استخدام وسيلة المخزن مؤقت مع حبيس المدرجة بالفعل.ملاحظة: يتم استخدام حبيس للحفاظ على قيمة pH الوسط أثناء قياس في الظروف المحيطة (مثلاً، خارج حاضنة ودون إمدادات ثابتة من2 CO). تأخذ قاسمة من الحل اللازم لتجربة والسماح لها الاحماء لدرجة حرارة الغرفة. 2 مل متوسطة غير كافية. يبقى الحل الأسهم المتبقية في 4 درجات مئوية. إعداد ومبومو المجهر.ملاحظة: تصف الخطوات التالية الإجراء لحامل المواصفات عينة تتكون من صفيحة قاعدة ألومنيوم وصحن ومبومو اكريليك إصلاحات ساترة والأزواج إلى positioner 3D كهرضغطية على حد سواء. كما يمكن استخدام أطباق الثقافة العقيمة المتاحة تجارياً مع أسفل زجاج.ملاحظة: يبين الشكل 5 صور فوتوغرافية لصاحب العينة المواصفات. ساترة مجهرية جديدة وشطفه بالمياه (المياه دي) والإيثانول. الهواء الجاف للشريحة مع النيتروجين أو الهواء المضغوط. تنظيف ساترة في جو بلازما الأوكسجين (0.3 [مبر] ضغط الغاز) لمدة 10 دقيقة في 500 “ث الترددات اللاسلكية” السلطة. يؤدي هذا إلى إزالة كل الشوائب العضوية من على سطح الأرض. تنظيف الطبق ومبومو اﻷكريليك بتخبط عليه في 0.2 mol/L حل هيدروكسيد الصوديوم لحوالي 10 دقيقة شطف مع الماء دي. تجميع صاحب العينة وتغطية ذلك مع بلاستيك طبق بيتري حتى حاجة في التجربة. الرقم 5: حامل العينة المواصفات. (أ) نموذج مكونات حامل: طبق ومبومو اﻷكريليك (1)؛ (2) الصفيحة القاعدية الألومنيوم؛ (3) عقد مسامير؛ (4) سيليكون الدائري؛ (5) ساترة. (ب) تجميع تماما صاحب العينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- إعداد المجهر. قم بتشغيل الليزر الإضاءة إيسكات وإضاءة ساطعة-الميدان/الأسفار الصمام والكاميرات واقتناء جهاز الكمبيوتر/البرامج. كتلة شعاع الليزر في موقف قبل الهدف. التأكد من أن 100 X/1.46 غ الهدف النظيف. إذا لم يكن الأمر كذلك، استخدم عدسة تنظيف الإيثانول ومناديل لتنظيف الهدف وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تطبيق قطره نفط الانغماس في المجهر والهدف. اتخاذ صاحب العينة (تجميعها في القسم 2-2) وجبل بعناية على مرحلة بيزو المجهر إيست حيث أنه يتم توسيط ساترة عينة على هدف المجهر. أن اليقظة والحذر حتى لا تتعرض للضرر العدسة الهدف. ربط الوحدة إلى positioner كهرضغطية مع مسامير الإبهام مع ضمان الشركة المصنعة المحددة عدم تجاوز أقصى عزم الدوران. إضافة 1 مل من الفحص المجهري الأسهم المتوسطة (أعدت في الفرع 2-1-) إلى ومبومو. إضافة 2 قطرات وصمة يوديد propidium إلى المتوسط كخلية موت علامة16،22. إلغاء حظر الليزر وجلب النظام إلى التركيز. أولاً، تحقق من أن الهدف هو وضع في المسافة الصحيحة من ساترة بتكرار الخطوات 1.2.3. -1-2-5. (الشكل 2). ثم، تهذيب التركيز مع محور ع المرحلة بيزو. تأكد من أن يتم تعيين كافة الإعدادات لمصادر الضوء، والكاميرات، والبرامج بشكل صحيح. وهذا يشمل المعلمات مثل طاقة الليزر، وكثافة الصمام، معدلات الإطار الكاميرا، ومرات التعرض الكاميرا أو برامج حفظ مسارات.ملاحظة: حفظ ملفات الفيديو في إطار ارتفاع معدلات يمكن أن تنتج أحجام الملفات الكبيرة. ضمان ما يكفي من المساحة الحرة على القرص على جهاز الكمبيوتر. كتلة شعاع الليزر مرة أخرى. المجهر جاهز الآن لتجربة. إعداد الخلايا.ملاحظة: Laz388 خلايا20 تستزرع في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% مصل العجل الجنين (FCS)، والأحماض الأمينية، بيروفات، والمضادات الحيوية. الخلايا هي المحتضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 وتقسيم وزودت متوسطة جديدة كل 2-3 أيام23. تأخذ قارورة ثقافة الخليوي من الحاضنة ونضح المتوسطة التي تحتوي على حوالي 1 × 106 خلايا. لتحديد وحدة التخزين الصحيحة، قياس تركيز ثقافة الخلية باستخدام هيموسيتوميتير. مزيج الحل خلية مع 10 مل متوسط RPMI 1640 في درجة حرارة الغرفة والطرد المركزي العينة على 300 غرام x لمدة 7 دقائق. استخراج وتجاهل المادة طافية مع ضمان بقاء بيليه تتركز الخلايا دون عائق بعناية. كرر الخطوات 2.4.2. -2.4.3. مع مركزة بيليه من الخلايا. تعليق إعادة الخلايا في 0.5 مل مجهرية الأسهم المتوسطة (أعدت في الفرع 2-1-) واستخدامها فورا في تجربة. 3-الفحص المجهري “خلايا إفراز” إيست ضمان أن يتم حظر شعاع الليزر لمنع الخلايا من التعرض مباشرة لضوء الليزر إيست. حقن الخلايا ومبومو عينة. حقن حوالي 3 ميليلتر خلية العينة (المعدة في القسم 2.4.) قليلاً قبالة مركز ومبومو عينة. اللمس بلطف نصيحة ماصة ساترة وحقن ببطء في حل الخلية. السماح للخلايا لتسوية على ساترة.ملاحظة: استخدم نصائح ماصة صغيرة الحجم (10 ميليلتر) أو نصائح هلام-تحميل طويلة ومرنة. ضمان أن كثافة الخلايا أمر أدناه حوالي 1 الخلية الواحدة 500 µm² حتى لا تتأثر قياسات خلية واحدة من خلايا متعددة في المنطقة المحيطة بالليزر إيست. وإذا كان العدد الخلايا منخفض جداً، كرر الخطوة 3.2.1. حتى يتوفر عدد كاف. إذا كان نطاق الخلايا كثيفة جداً، استخدام حقنه من حوالي 20 ميليلتر من المتوسطة مجهرية إضافية لتفريق الخلايا عبر ساترة. استخدام ميضعه بيزو، نقل العينة جانبياً لموقف خلية قريبة (حوالي 10 ميكرون) لمجال الرؤية إيست. تأكد من أن الخلية لا يدخل في مجال الرؤية إيست التعرض المباشر لضوء الليزر شمال البحر الأبيض المتوسط 445 قد تكون ضارة للخلية. استخدام صور مشرقة الميدانية والأسفار لتحديد موقع والتحقق من صلاحية للخلية25.ملاحظة: خلية قابلة للتطبيق بشكل دائري في صورة مشرقة الحقل ولا الفلورسنت، بينما يشار إلى موت الخلية بإشارات الأسفار القوى الناشئة عن وجود يوديد propidium داخل الخلية22. إلغاء حظر شعاع الليزر إيست والتأكد من أن السطح ساترة لا يزال في التركيز. أرفق الجدول العزلة للحد من الانجراف واقتران الصوتية من محيط المحيط.ملاحظة: يتم هذا الأخير مع الستائر الثقيلة الضوئية أو لوحات اﻷكريليك المحيطة بالجدول البصرية. بدء القياس بجلب الصور من الكاميرات إيسكات ومشرق الميدانية، والأسفار. أتمتة والتحكم في العملية من خلال برامج تحقيق أقصى قدر من الكفاءة التجريبية. فحص دوري لبقاء الخلية وتركيز النظام.ملاحظة: اعتماداً على كثافة الليزر، والمكونات البصرية، والتعرض الوقت إعدادات الكاميرا، قد تتداخل الليزر إيست مع الكاميرا الأسفار. إذا كان هذا السلوك هو ملاحظة، النظر في الشدات الليزر إيست مؤقتاً أثناء الأسفار صورة التملك. 4. تحليل البيانات ملاحظة: البيانات التجريبية أصلاً صاخبة، وصور إيست، لا تختلف. وهناك عدة مصادر للضوضاء في قياس إيست نموذجية، بما في ذلك التشوهات واجهة الموجه في الحادث من مصدر الضوء، وخشونة السطح ساترة، والضوضاء الكاميرا. ويعرض الفرع الوارد أدناه بعض الطرق التي يتم تدارك هذه المصادر الضوضاء عن طريق تجهيز آخر. بالإضافة إلى ذلك، القلاقل الميكانيكية الأفقي للإعداد يؤدي إلى بيانات صاخبة ويجب معالجتها وفقا لذلك، كما هو موضح في المقطع “مناقشة” أدناه. وتجري التحليلات التي وصفت مع البرامج النصية المخصصة MATLAB. تقليل الضوضاء الكاميرا بتصفية البيانات الخام مع عامل تصفية فورييه ثنائي الأبعاد التي تستثني الترددات المكانية العالية. حجم عامل التصفية تحتاج إلى تعديلها لتناسب تكوين تجريبية محددة (معظمهم يحدده الفتحة العددية للنظام).ملاحظة: ملامح الصورة بأعلى الترددات المكانية من النظام البصري تأتي من مصادر خارجية (مثل الضوضاء القراءة الكاميرا) ويمكن إهمال. تحويل الصور من الكاميرا الخام التهم إلى التباين إيست.ملاحظة: إشارة الكشف عنها بواسطة الكاميرا . يعرف التباين إيسكات حيث هو كثافة الضوء الإشارة، في هذه الحالة الجزء الذي تعكسه ساترة، و هو التدخل بين وكثافة متفرقة (). فصل الإشارة إلى و بحساب الوسط الزماني إطارات خاصة فيها جسيمات الفائدة ليست موجودة. الصورة الناتجة توفر إشارة مرجعية .ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن إجراء خطوة طرح خلفية نشط كما هو موضح في المناقشة الواردة أدناه. حساب التباين استناداً إلى 12،،من1416. إنشاء صورة تفاضلية متداول بطرح كل إطار على التوالي من خلفه.ملاحظة: الإشارات المتبقية من خشونة السطح من ساترة وفعالية إزالة التشوهات واجهة الموجه في هذه الخطوة كما ثابتة داخل إطارات متتالية. الفرق المتداول يزيل هذه الإشارات المتبقية، تاركاً فقط روابط البروتين التي تحدث من إطار واحد إلى التالي. مفيد هذا الطرح خلفية حيوية كما أنها ليست حساسة للأجل عينة الانجرافات. تطبيق خوارزمية ذروة تسعى لكشف وفهرسة الجزيئات واحدة لكل إطار وتحديد التباين المحددة والموقف. استخدام المعلومات التي تم جمعها في الخطوة 4، 4 لإنشاء رسوم بيانية للبروتين ربط أحداث وتتعلق تناقضات المستخرجة إلى كتلة البروتين من خلال منحنى معايرة تم تجميعها من البروتين المعروفة عينات14،24.