Purificação de células Low-abundante no sistema Visual da drosófila
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de dissociação de célula para isolar eficientemente células presentes em baixa abundância dentro do sistema visual de Drosophila através de célula de fluorescência ativada classificação (FACS).
Abstract
Recentes melhorias na sensibilidade do sequenciamento de próxima geração facilitaram a aplicação de transcriptomic e análises genômicas para pequeno número de células. Utilizar esta tecnologia para estudar o desenvolvimento do sistema visual de Drosophila, que ostenta uma riqueza de ferramentas genética de tipo específico de célula, fornece uma abordagem poderosa para abordar a base molecular do desenvolvimento com resolução de celular precisa. Para tal abordagem viável, é fundamental ter a capacidade de forma confiável e eficiente de purificar células presentes em baixa abundância dentro do cérebro. Aqui, apresentamos um método que permite a purificação eficiente de clones de célula única em experimentos de mosaico genético. Com este protocolo, consistentemente alcançamos um alto rendimento celular após purificação usando fluorescência ativado celular classificação (FACS) (~ 25% de todas as células rotuladas) e realizou com sucesso transcriptomics análises na única célula clones gerados através de análise de mosaico com um marcador de célula repressible (MARCM). Este protocolo é ideal para a aplicação transcriptomic e análises genômicas para tipos específicos de células no sistema visual, em diferentes estágios de desenvolvimento e no contexto de diferentes manipulações genéticas.
Introduction
O sistema visual da drosófila é um excelente modelo para o estudo a base genética do desenvolvimento e comportamento. É composto por uma arquitetura celular estereotipados1 e um conjunto de ferramentas de genético avançado para manipular tipos de célula específica2,3. Uma força principal deste sistema é a capacidade de interrogar autonomamente a função do gene em tipos de células de interesse com resolução única célula, usando métodos de mosaico genético4,5. Análises genômicas em única célula clones em experimentos de mosaico genético e procurámos combinar estas ferramentas genéticas com recentes avanços no sequenciamento de geração seguinte para executar transcriptomic de tipo específico de célula.
Para fazer isso, é essencial desenvolver um método robusto e eficiente para seletivamente isolar populações de baixa abundantes células no cérebro. Anteriormente, desenvolvemos um protocolo para isolar tipos de células específicas do sistema visual durante o desenvolvimento pupal através de FACS e determinando suas transcriptomes usando o RNA-seq.6. Nesses experimentos, a grande maioria das células de um tipo específico (por exemplo, R7 fotorreceptores) fluorescente foram rotulada. Usando esse método, em experimentos de mosaico genético, no qual apenas um subconjunto de células do mesmo tipo são rotulados, não conseguimos isolar células suficientes para obter dados de sequenciamento de qualidade. Para resolver isso, procuramos aumentar o rendimento celular melhorando o protocolo de dissociação de célula.
Nossa abordagem foi para diminuir o comprimento total do protocolo para maximizar a saúde das células dissociadas, melhorar a saúde celular, alterando os buffers de dissecção e dissociação e reduzir a quantidade de ruptura mecânica no tecido dissecado. Nós testamos o melhor protocolo7 usando análise de mosaico com uma célula repressible marcador5 (MARCM), que permite a geração de único fluorescente etiquetado clones de tipos de célula específica, que são tipo selvagem ou mutante para um gene de interesse em uma caso contrário heterozigota mosca. Onde, em condições idênticas, o nosso protocolo anterior falhou gerar material suficiente para RNA-seq, o protocolo melhorado foi bem sucedido. Nós reproducibly atingir um alto rendimento celular (~ 25% de pilhas etiquetadas) e obter dados de RNA-seq de alta qualidade de tão pouco como 1.000 células7.
Um número de protocolos têm sido descrito anteriormente para isolar os tipos de célula específica em Drosophila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. estes protocolos destinam-se principalmente para isolar as células que são abundantes dentro do cérebro. Nosso protocolo é otimizado para isolar populações de células abundantes baixa (menos de 100 células por cérebro) no sistema visual usando FACS para posterior transcriptomic e análises genômicas. Com este protocolo, nosso objetivo é fornecer uma maneira de isolar reproducibly baixas abundantes células do sistema visual de voar pela FACS e obtenção de dados de alta qualidade transcriptome por RNA-Seq
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo é simples e não é tecnicamente difícil de executar, mas há chave de várias etapas que se negligenciado irá causar uma redução considerável no rendimento celular. (Etapa 2.3.2.) É crucial que as cruzes são saudáveis, e que a comida não secar. Molhar regular de cruzes é essencial para maximizar o número de moscas disponíveis para dissecação que estão com o mesmo genótipo e a correta fase de desenvolvimento. Quantas vezes cruzes precisa ser regada irá variar dependendo o alimentos utiliz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo NINDS dos institutos nacionais de saúde, sob número do prêmio K01NS094545, andgrants do centro para o estudo de doenças neurodegenerativas Lefler. Reconhecemos a calagem Tan e Jason McEwan para conversas valiosas.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
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