Reinigung des Low-reichlich Zellen im visuellen System von Drosophila
Summary
Hier präsentieren wir eine Zelle Dissoziation Protokoll für effizient bei geringen Fülle innerhalb des visuellen Systems der Drosophila durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) Zellen zu isolieren.
Abstract
Verbesserungen in der Empfindlichkeit der Sequenzierung der nächsten Generation haben die Anwendung von transkriptomischen und genomische Analysen auf eine kleine Anzahl von Zellen erleichtert. Nutzt diese Technologie, um die Entwicklung in dem visuellen System von Drosophila zu untersuchen, die eine Fülle von Zelle-spezifischen genetischen Werkzeuge bietet, liefert einen leistungsfähigen Ansatz für die Bewältigung der molekularen Grundlagen der Entwicklung mit genauen zellulären Auflösung. Für einen solchen Ansatz realisierbar ist es wichtig in der Lage, zuverlässig und effizient bei geringen Fülle im Gehirn Zellen zu reinigen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die effiziente Reinigung von einzelnen zellklonen im genetischen Mosaik Experimente ermöglicht. Mit diesem Protokoll erreichen wir konsequent einen hohen zellulären Ertrag nach der Reinigung mit Fluoreszenz Zelle Sortieren (FACS) (~ 25 % aller markierten Zellen) aktiviert, und erfolgreich Transkriptom-Analysen auf einzelne zellklonen erzeugt durch Mosaik-Analyse mit einem tragen Zelle Marker (MARCM). Dieses Protokoll ist ideal für die Anwendung von transkriptomischen und genomische Analysen zu spezifischen Zelltypen im visuellen System in verschiedenen Stadien der Entwicklung und im Zusammenhang mit verschiedenen genetischen Manipulationen.
Introduction
Das visuelle System von Drosophila ist ein hervorragendes Modell für die Erforschung der genetischen Grundlagen von Entwicklung und Verhalten. Es umfasst eine stereotype zellulären Architektur1 und eine erweiterte genetische Toolkit zur Bearbeitung von bestimmten Zelle Arten2,3. Die große Stärke dieses Systems ist die Fähigkeit, selbstständig zu verhören Genfunktion in Zelltypen des Interesses mit einzelligen Auflösung, mit genetischen Mosaik Methoden4,5. Wollten wir diese genetische Werkzeuge mit den jüngsten Fortschritten in der nächsten Generation Sequenzierung durchzuführen Zelle typspezifischen transkriptomischen kombinieren und genomische Analysen in einzelne Zelle Klone in genetischen Mosaik Experimente.
Um dies zu erreichen, ist es wichtig, eine robuste und effiziente Methode, um niedrige reichlich Zellpopulationen im Gehirn selektiv isolieren zu entwickeln. Zuvor haben wir ein Protokoll für bestimmte Zelltypen im visuellen System während pupal Entwicklung durch FACS zu isolieren und bestimmen ihre Transkriptom mittels RNA-Seq6entwickelt. In diesen Experimenten wurden die überwiegende Mehrheit der Zellen eines bestimmten Typs (z. B. R7 Photorezeptoren) eindringmittel beschriftet. Mit dieser Methode in genetischen Mosaik-Experimente, wobei nur eine Teilmenge von Zellen des gleichen Typs sind beschriftet, konnten wir genügend Zellen zur Sequenzierung Qualitätsdaten erhalten zu isolieren. Um dieses Problem anzugehen, haben wir versucht, den zellulären Ertrag zu steigern, durch die Verbesserung der Zelle Dissoziation Protokoll.
Unser Ansatz war es, die Gesamtlänge des Protokolls zum Maximieren der Gesundheit der dissoziierten Zellen, Verbesserung der zellulären Gesundheit durch Veränderung der Dissektion und Dissoziation Puffer zu verringern, und reduzieren die Menge der mechanischen Störung des sezierten Gewebes. Wir testeten die verbesserte Protokoll7 mit Mosaik-Analyse mit einem tragen Zelle Marker5 (MARCM), wodurch Generation Single eindringmittel beschriftet Klone von bestimmten Zelltypen, die Wildtyp oder Mutant für ein Gen des Interesses an einer Ansonsten heterozygot fliegen. Wo unter identischen Bedingungen unserer früheren Protokoll konnte nicht genügend Material für RNA-Seq generiert, war das verbesserte Protokoll erfolgreich. Wir reproduzierbar zellulären ertragreich (~ 25 % der markierten Zellen) und hohe Datenqualität RNA-Seq von weniger als 1.000 Zellen7erhalten.
Eine Reihe von Protokollen sind bisher beschrieben worden, um bestimmte Zelltypen in Drosophila6,8,9,10,11,12,13 isolieren , 14 , 15 , 16. diese Protokolle sind vor allem gedacht für die Isolierung von Zellen, die reichlich im Gehirn sind. Unser Protokoll ist optimiert für geringe reichlich Zell-Populationen (weniger als 100 Zellen pro Gehirn) im visuellen System mit FACS für nachfolgende transkriptomischen und genomische Analysen zu isolieren. Mit diesem Protokoll wollen wir bieten eine Möglichkeit, niedrige reichliche Zellen aus dem Fliegen visuelle System indem Sie FACS und hohe Datenqualität durch RNA-FF Transkriptom reproduzierbar zu isolieren
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ist einfach und nicht technisch schwierig zu realisieren, aber es gibt einige wichtige Schritte, die wenn Sie übersehen wird dazu führen, dass eine erhebliche Reduzierung in zellulären Ausbeute. (Schritt 2.3.2.) Es ist entscheidend, dass Kreuze gesund sind, und dass das Essen nicht austrocknet. Regelmässige Bewässerung der Kreuze ist wichtig, die Anzahl der fliegen zur Dissektion zu maximieren, die von der richtigen Genotyp und in der richtigen Phase der Entwicklung. Wie oft kreuzen müssen gewässe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch das NINDS von den National Institutes of Health unter prämiennummer K01NS094545, Andgrants von Lefler Mitte für die Studie von neurodegenerativen Erkrankungen finanziert. Wir erkennen Kalkung Tan und Jason McEwan für wertvolle Gespräche.
Materials
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | Proteolytic enzyme blend |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-Glutathione | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| Heat Inactivated Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Insulin Solution | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's Culture Medium | Gibco | 21720024 | |
| Papain | Worthington | LK003178 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA purification kit |
| RNase-free DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP Mix | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 Solution | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| Betaine Solution | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA Library Prepration Kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Bottle-Top Vacuum Filter Systems | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria Flow Cytometer | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY–401–2501 |
References
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
- Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
- Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
- Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
- Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
- Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).
