הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית
Summary
אנו מתארים את מכלול, המבצע, ועוצב ניקוי של מנגנון זרימה כדי התמונה פטרייתי ביופילמים בזמן אמת בזמן תחת זרימה. אנחנו גם מספקים ולדון אלגוריתמים כמותיים כדי לשמש על תמונות נרכשות.
Abstract
ב קנדידה הלוע התחתון, חברי קנדידה חייב לדבוק ולגדול על פני השטח הרירית אוראלי בעוד תחת השפעת זרימת הרוק. בעוד פותחו מודלים עבור הגידול תחת זרימה, רבות ממערכות אלה יקרים, או אל תאפשר הדמיה בזמן התאים נמצאים תחת זרימה. פיתחנו מנגנון הרומן זה מאפשר לנו תמונה את הצמיחה וההתפתחות של תאי קנדידה אלביקנס תחת זרימה בזמן אמת. כאן, אנו מפרטים הפרוטוקול על הרכבה ועל השימוש והתותח זרימה, כמו גם כימות של נתונים שנוצרו. אנחנו יכולים לכמת את קצבי התאים לצרף ולנתק מהשקופית, כמו גם לקבוע מדד של ביומסה בשקופית לאורך זמן. מערכת זו הוא חסכוני ורב -גונית לעבוד עם סוגים רבים של מיקרוסקופ אור, כולל מיקרוסקופ benchtop זול, מסוגל מורחב הדמיה פעמים בהשוואה למערכות אחרות זרימה. בסך הכל, זה מערכת תפוקה נמוכה יכול לספק מידע בזמן אמת מאוד מפורט על הגידול biofilm של מינים פטרייתי תחת זרימה.
Introduction
קנדידה אלביקנס (אלביקנס ג) הוא פתוגן פטרייתי הזדמנותית של בני אדם שיכולים להדביק סוגי רקמות רבים, כולל אוראלי משטחים הרירית, גורם קנדידה הלוע התחתון, וכתוצאה מכך איכות חיים נמוכה יותר עבור אנשים מושפעים1. ביופילמים היא מאפיין חשוב בפתוגנזה של ג אלביקנס, מחקרים רבים נעשו על היווצרות ועל תפקוד אלביקנס ג biofilms2,3,4, 5, שרבים מהם נערכו באמצעות חשמל סטטי (אין זרימת) במבחנה מודלים. עם זאת, אלביקנס ג חייב לדבוק ולגדול בנוכחות זרימת הרוק בחלל הפה. מערכות זרימה רבים פותחו כדי לאפשר לחיות תאים הדמיה6,7,8,9,10. מערכות זרימה שונים אלה עוצבו למטרות שונות, לכן לכל מערכת יש והחולשות שונים. מצאנו כי רבים מן הזרם מערכות מתאים אלביקנס ג היו יקרים, נדרש מתחם מפוברק חלקים, או יכול לא להיות עם תמונה במהלך הזרימה, היה צריך לעצור לפני הדמיה. לכן, פיתחנו מנגנון זרימת הרומן ללמוד אלביקנס ג ביופילמים תחת זרימה11. במהלך העיצוב של מנגנון הזרימה שלנו, עקבנו אלה השיקולים המרכזיים. ראשית, רצינו להיות היכולת לכמת את מספר היבטים biofilm הצמיחה וההתפתחות ב בזמן אמת ללא צורך את השימוש פלואורסצנט תאים (המאפשר לנו זנים מוטציה המחקר, מבודד קליניים יאומתו בקלות). שנית, רצינו כל החלקים יהיו זמינים מסחרית עם מעט שינויים לא (כלומר., אין ייצור מותאם אישית), ומאפשר לאחרים יותר בקלות לשחזר את המערכת שלנו, המאפשרות תיקונים קלים. שלישית, גם רצינו לאפשר עבור המורחבת הדמיה פעמים במחירים זרימה גבוהה יחסית. לבסוף, רצינו, לאחר תקופה של תאים לצרף המצע תחת זרימה, להיות מסוגל לפקח על צמיחה biofilm לאורך זמן ממושך ללא החדרת תאים חדשים.
שיקולים אלו הובילו אותנו לפתח את הבקבוק-שני recirculating מערכת הזרימה מאויר באיור1. שתי המבחנות מאפשרים לנו לפצל את הניסוי לתוך בשני שלבים, שלב מצורף שמושך מן הבקבוק מצורף נזרע תא ושלב הצמיחה המשתמשת מדיה ללא תא כדי להמשיך את הצמיחה biofilm ללא התוספת של תאים חדשים. מערכת זו מיועדת לעבודה עם חדר דגירה על המיקרוסקופ, עם השקופית, הצנרת לתו זה (2-5, איור 1) להצבה בתוך החממה, והניח כל שאר הרכיבים במיכל המשני גדול בחוץ מיקרוסקופ. בנוסף, קדירות פלטה עם רגש טמפרטורה המצורפת משמש כדי לשמור על תאים פטרייתי הבקבוקון קובץ מצורף ב- 37 מעלות צלזיוס. כמו זה הוא צואה, מערכת זו הוא מסוגל הדמיה רציפה במהלך הזרימה (יכול להיות מעל 36 h בהתאם לתנאים), ניתן להשתמש מיקרוסקופים סטנדרטי ביותר, כולל מיקרוסקופ benchtop ישר או הפוך. כאן, נדון ההרכבה, המבצע, ומספקים ניקוי על מנגנוני זרימה, כמו גם כמו כמה אלגוריתמים בסיסיים ImageJ כמותיים כדי לנתח קטעי וידאו לאחר ניסוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות מערכת הזרימה כמתואר לעיל מאפשר לדור של קטעי וידאו זמן לשגות כמותית של biofilm פטרייתי צמיחה והתפתחות. כדי לאפשר השוואות בין ניסויים זה חשיבות חיונית על מנת להבטיח כי הפרמטרים הדמיה נשמרים זהה. זה כולל הבטחת כי המיקרוסקופ מוגדרת לתאורת קוהלר עבור ניסוי (מדריכים רבים זמינים באינטרנט עב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להכיר ד ר ווייד עורכת הדין למתן ערך קלט בעיצוב של המנגנון זרימה.
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).
