التصوير في الوقت الحقيقي والتحديد الكمي للتنمية بيوفيلم الفطرية باستخدام نظام تدفق دائرية ذات مرحلتين
Summary
يصف لنا الجمعية العامة، عملية، وتنظيف جهاز تدفق تهدف إلى تكوين بيوفيلم الفطرية الصور في الوقت الحقيقي في حين ظل تدفق. ونحن أيضا تقديم ومناقشة خوارزميات الكمية المراد استخدامه على الصور المكتسبة.
Abstract
في داء المبيضات المكنسية، يجب التقيد بأعضاء جنس المبيضات وتنمو على سطح الغشاء المخاطي الشفوي في حين ظل آثار تدفق اللعاب. بينما تم تطوير نماذج للنمو في ظل تدفق، العديد من هذه النظم غالية الثمن، أو عدم السماح بالتصوير في حين الخلايا قيد التدفق. قمنا بتطوير جهاز رواية التي تسمح لنا بصورة نمو وتطور الخلايا المبيضات البيض في ظل تدفق وفي الوقت الحقيقي. هنا، نحن تفاصيل البروتوكول للجمعية واستخدام هذا الجهاز التدفق، فضلا عن التحديد الكمي للبيانات التي يتم إنشاؤها. نحن قادرون على تحديد المعدلات التي نعلق على الخلايا، وفصل من الشريحة، فضلا عن تحديد مقياس للكتلة الأحيائية على الشريحة مع مرور الوقت. هذا النظام اقتصادا وتنوعاً، وتعمل مع العديد من أنواع المجاهر الخفيفة، بما فيها مجاهر benchtop غير مكلفة، على حد سواء، وقادر على تمديد التصوير مرات مقارنة بغيرها من نظم تدفق. عموما، هذا هو نظام منخفضة الإنتاجية التي يمكن أن توفر معلومات مفصلة للغاية في الوقت الحقيقي على نمو بيوفيلم الأنواع الفطرية تحت التدفق.
Introduction
المبيضات البيض (المبيضة) هو الممرضات فطرية انتهازية من البشر التي يمكن أن تصيب العديد من أنواع الأنسجة، بما في ذلك الأسطح المخاطية الفموية وتسبب داء المبيضات المكنسية ونتج عنه انخفاض نوعية حياة للأفراد المتضررين1. تشكيل بيوفيلم سمة هامة للآلية المرضية المبيضة، وقد أجريت دراسات عديدة على تكوين ووظيفة المبيضة الأغشية الحيوية2،،من34، 5، أجريت الكثير منها ثابت (لا التدفق) في المختبر باستخدام النماذج. ومع ذلك، المبيضة يجب التقيد وتنمو حضور تدفق اللعاب في تجويف الفم. وقد وضعت العديد من نظم تدفق للسماح لخلية يعيش التصوير6،،من78،9،10. وقد صممت هذه الأنظمة تدفق مختلفة لأغراض مختلفة، وذلك كل نظام مختلف نقاط القوة والضعف. وجدنا أن العديد من تدفق النظم الملائمة المبيضة كانت مكلفة، المعقدة المطلوبة ملفقة أجزاء، أو يمكن عدم تصويرها أثناء تدفق وكان أن توقفت قبل التصوير. ولذلك، قمنا بتطوير جهاز تدفق رواية لدراسة المبيضة بيوفيلم تشكيل إطار تدفق11. أثناء تصميم جهازنا التدفق، تابعنا هذه الاعتبارات الرئيسية. أولاً، أننا نريد أن تكون قادرة على قياس جوانب متعددة من بيوفيلم النمو والتنمية في الوقت الحقيقي دون الحاجة إلى استخدام خلايا الفلورسنت (مما يسمح لنا لدراسة سلالات متحولة ويعزل السريرية غير معدلة بسهولة). ثانيا، كنا نريد جميع أجزاء لتكون متاحة تجارياً مع قليل من لا تعديلات (أي.، لا تلفيق مخصصة)، والسماح للآخرين بأكثر بسهولة إعادة إنشاء نظامنا، والسماح للتصليح سهلة. ثالثا، أردنا أيضا للسماح بتمديد التصوير مرات في معدلات التدفق مرتفعة بشكل معقول. وأخيراً، أردنا، بعد فترة من الخلايا إرفاق الركيزة تحت التدفق، لتكون قادرة على رصد النمو بيوفيلم على مدى فترة طويلة دون إدخال خلايا جديدة.
هذه الاعتبارات أدت بنا إلى تطوير نظام تدفق تدوير قارورة اثنين هو موضح في الشكل 1. قوارير اثنين تسمح لنا بتقسيم هذه التجربة إلى مرحلتين، مرحلة مرفق يستمد من قارورة مرفق المصنف الخلية، ومرحلة نمو التي تستخدم وسائل الإعلام الحرة خلية على مواصلة نمو بيوفيلم دون إضافة خلايا جديدة. صمم هذا النظام للعمل مع غرفة حضانة للمجهر، مع الشريحة والأنابيب السابقة لها (2 إلى 5، الشكل 1) يتم وضعها داخل الحاضنة، وتوضع جميع المكونات الأخرى في حاوية كبيرة ثانوي خارج المجهر. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام محرض هوتبلت مع مسبار درجة حرارة مرفقة الحفاظ على الخلايا الفطرية في قارورة المرفقات عند 37 درجة مئوية. كما أنه يتم تعميم، هذا النظام قادر على تصوير مستمر أثناء تدفق (يمكن أن يكون أكثر من 36 ح تبعاً للظروف)، ويمكن استخدامها على المجاهر الأكثر القياسية، بما في ذلك مجاهر benchtop رأسي أو مقلوب. هنا، نحن مناقشة الجمعية العامة، عملية، وتنظيف جهاز تدفق، كذلك كما تقدم بعض الخوارزميات ImageJ الكمية الأساسية لتحليل أشرطة الفيديو بعد تجربة.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام نظام تدفق كما هو مبين أعلاه يسمح لتوليد كمية من أشرطة الفيديو الوقت الفاصل بين بيوفيلم الفطرية في النمو والتنمية. للسماح بإجراء مقارنات بين التجارب أنها ذات أهمية حاسمة لضمان بقاء المعلمات التصوير نفسه. وهذا يشمل ضمان أن يتم إعداد المجهر لإنارة كوهلر لكل تجربة (أدلة كثيرة على شبك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن ينوه الدكتور واد سيجوردسون لتقديم مساهمة قيمة في تصميم جهاز التدفق.
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).
