Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için
Summary
Burada, içinde yüksek üretilen iş ekran ekstraselüler protein microarrays kimliği roman reseptör-ligand etkileşimleri için bir iletişim kuralına mevcut. Ayrıca protein-microbead kompleksleri kullanarak geçici protein-protein etkileşimlerinin algılama geliştirmek için bir yöntem açıklar.
Abstract
Salgılanan faktörler, membran hayvan zinciri reseptörleri ve etkileşen eşleri hücresel iletişim ana düzenleyiciler ve inisiyasyon cascades homeostazı ve hastalık sırasında sinyal ve bu nedenle ana tedavi hedefleri temsil. Kendi alaka rağmen bu etkileşim ağları önemli ölçüde geçerli veritabanlarında underrepresented kalır; Bu nedenle, en hücre dışı proteinler belgelenmiş bağlama ortak var. Öncelikle fonksiyonel proteinler ve zayıf, düşük benzeşme kez hücre yüzey reseptörlerinin arasında kurulan protein etkileşimleri ifadesi de dahil olmak üzere hücre dışı proteinler incelenmesi ile ilgili sorunlar nedeniyle bu tutarsızlık olduğunu. Bu yöntemin amacı bir kütüphane Mikroarray kartvizitlere protein-protein etkileşimleri ile taranması için hücre dışı proteinlerin baskısı tarif etmektir. Zayıf etkileşimlerin algılamasını etkinleştirmek için multimerization sorgu protein altında eğitim dayalı bir yöntemi açıklanmıştır. Artan multivalency için bu multimerization microbead tabanlı yaklaşımın birleştiğinde, protein mikroarray geçici protein-protein etkileşimlerinin sağlam algılama içinde yüksek üretilen iş sağlar. Bu yöntem bir hızlı ve düşük örnek tüketen-yaklaşım yeni etkileşimler ilgili ekstraselüler herhangi bir protein tanımlanması için sunuyor. Protein mikroarray baskı ve protokol filtreleme açıklanmıştır. Bu teknoloji araştırmacılar protein etkileşimleri ekstrasellüler alanda keşfi için sağlam bir yöntem arayışı için faydalı olacaktır.
Introduction
Burada gözden yöntemi Mikroarray biçiminde, bu kütüphane karşı ilgi bir hedef ile taranması için bir yöntem ve ardından hücre dışı proteinler topluluğu yazdırma işlemi açıklar. Biz düşük bağlama benzeşim tarafından karakterize etkileşimleri algılanması için çok önemli bir adım olarak protein multimerization belirledik. Bu etkileşimlerin algılama geliştirmek için üzerinde ilgi lastikteki kullanarak sorgu proteinin multimerization dayalı bir iletişim kuralı açıklar.
Salgılanan ve hücresel iletişim, sinyal ve microenvironment ile etkileşim anahtar düzenleyiciler (toplu olarak adlandırdığı hücre dışı proteinler) hücre yüzey-proteinlerin etkileşen eşleri ile birlikte vardır. Onlar, bu nedenle, birçok fizyolojik ve patolojik süreçlerinin düzenlenmesinde gereklidir. İnsan genomu (≈5, 000 proteinler) yaklaşık dörtte hücre dışı proteinler için kodlar, onların önemi ve erişilebilirlik için sistematik olarak teslim edilen uyuşturucu göz önüne alındığında, ilaç geliştirme1için anahtar hedefler temsil eder. Sonuç olarak, hücre dışı proteinler bilinen farmakolojik eylem “druggable” proteomu olarak piyasada onaylı ilaçlar için protein hedeflerle % 70’den fazla temsil eder. Onların önemi ve bereket rağmen ekstraselüler protein-protein etkileşim (ePPI) ağları kullanılabilir veritabanları son derece underrepresented kalır. Bu temelde hangi en çok kullanılan teknolojileri2kullanarak onların karakterizasyonu engellemektedir karmaşık biyokimyasal yapısı hücre dışı proteinler nedeniyle var. İlk olarak, zar proteinleri, sık sık sert çamaşır koşulları ve deterjanlar içerir bir işlem solubilize zordur; İkinci olarak, ne zaman bu proteinler yaygın olarak ifade edilir yok olan glikozilasyon Contegra sistemleri kullanılan gibi hücre dışı proteinler genellikle ilgili translasyonel modifikasyonlar eksikliği. Son olarak, Co reseptörleri bağışıklık hücreleri üzerinde ifade gibi reseptörleri arasındaki etkileşimler çoğu kez geçici ve çok düşük benzeşim karakterize (KD ~ 1 mikron > 100 mikron aralığı). Tamamen, bu proteinler ve ortakları en çok render kendi bağlama benzeşme arıtma/kütle spektrometresi (AP/MS) veya Maya-iki-hibrid, ekstrasellüler alanda etkileşimleri algılanması için uygun olmayan gibi teknolojileri kullanılmaktadır 2 , 3.
Bu teknik zorlukların üstesinden ve hücre dışı proteinler için roman etkileşimler bulma hızlandırmak için bir çaba olarak, bir yüksek kapsama ekstraselüler protein mikroarray4,5geliştirdik. Microarrays yüksek yoğunluklu yüzeyler örnek küçük miktarda üreten avantajı sunuyor ve genellikle yüksek üretilen iş çalışmaları için mükellef bulunmaktadır. Protein mikroarray tabanlı çalışmalar daha önce de olsa esas olarak sitozolik etkileşimleri veya belirli protein aileler6,7odaklanarak ilgili birkaç model organizmalar için protein etkileşimler anlayışlar sağlamış, 8. Buna ek olarak, sınırlı iş bu teknolojiyi kullanarak hücre dışı protein etkileşimleri araştırmak için yapılmıştır. EPPIs çalışmaların arıtılmış salgılanan proteinler kapsamlı ve çok çeşitli Kütüphane binası tarafından etkinleştirmek için bir protein mikroarray yöntemi geliştirdik ve tek transmembran (STM) reseptörleri için erimiş olarak rekombinant ekstrasellüler etki alanları (ECD) dile getirdi. yaygın Etiketler benzeşme arıtma4için. Protein mikroarray ekranlar başarısı ağır bir yüksek kaliteli protein Kütüphane kurulması dayanmaktadır. Kütüphane ve sorgu protein ifadesi için memeli hücreleri veya böcek hücreleri tercihen Contegra ifade sistemleri olarak translasyonel modifikasyonlar glikozilasyon veya disülfür bağları gibi uygun ek sağlamak için seçilmiştir. SDS-sayfa, boyutu dışlama Kromatografi ve çok açılı lazer ışık saçılma Rekombinant protein kalitesini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan tekniklerdir. Protein Kütüphane sonra epoxysilane slaytlar tespit ve uzun vadeli kullanım için-20 ° C’de depolanan. Yukarıda protein konsantrasyonları 0.4 mg/mL aşağıda belirtilen iletişim kuralı için tavsiye edilir. Bu nedenle, düşük ifade protein konsantrasyonu adım önce örnek baskı ve depolama gerektirebilir. Yine de, bu teknik büyük bir avantajı gerekli protein küçük birimdir (protein 50 μg gerçekleştirmek için yeterli > 2000 ekranları), en az sorgu protein tüketiminin (yineleme ekran başına 20-25 μg) yanında. İletişim kuralı ve ekipmanlar kullanarak burada açıklanan ve kitaplıklar mevcut olması şartıyla, bireysel sorgu proteinler için sonuçlar bir iş günü içinde oluşturulabilir.
Kimlik tarafından en sık kullanılan metodolojiler engellemektedir onların karakteristik zayıf veya geçici doğa içinde protein etkileşimleri ekstraselüler ortamda hafiye büyük bir meydan okuma kaynaklanmaktadır. Bağlama hırs büyük ölçüde artan duyarlılık zayıf protein etkileşimleri9,10,11algılanması için geliştirir. Multimerize bir yönteme geliştirdiğimiz bu ilke (Fc füzyon olarak) sorgu proteinlerin temel protein A kaplı boncuk4,5kullanarak. Biz bunun yerine bir alakasız insan immünoglobulin G Cy5 ile etiket ve böylece herhangi bir eserler doğrudan fiil nedeniyle ortadan kaldırarak protein A boncuk için sorgu protein ile birlikte ekleyin rasgele etiketleme tarafından herhangi bir potansiyel inactivation sorgu protein önlemek için bir faiz protein boya. Birkaç ortak reseptör çiftleri micromolar benzeşim göz önüne alındığında, multivalent kompleksleri büyük sinyal gürültü oranı, çözünür proteinler4ekranlı Fc-füzyon sorgu proteinler karşılaştırıldığında geliştirmek.
Özet olarak, bu iletişim kuralının amacı reseptör-ligand etkileşimlerin tanımlanması için önceden varolan bir hücre dışı protein kitaplığı içeren Mikroarray slaytların hazırlanması tarif etmektir. Yazdırma, tarama bir proteinin hücre dışı protein Kütüphane karşı ilgi için bir iletişim kuralı ve ardından slayt için adımları gözden geçirin. Ayrıca, gelişmiş lastikteki artan hırs altında eğitim protein elde etmek için temel ePPIs tespiti için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan ekstraselüler protein mikroarray teknoloji tarama ve Roman ePPI düşük yanlış pozitif oranları ile ve algılama tek mikrogram miktarların altında sorgu proteinin kullanan tarafından için hızlı, sağlam ve etkili bir yaklaşım temsil eder. soruşturma. Bu teknoloji reseptörleri12,13viral immunoregulators14dahil olmak üzere, çeşitli için ilgili yorumlara önceden bilinmeyen hücresel işlevler ve sinyal yollar sağlayan birden fazla çalışmalar yakıt, ve hücre dışı herhangi bir protein ilgi de-orphanize için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yetim reseptörleri önemli sayıda insan genom kalır ve Roman etkileşen ortakları daha önce karakterize ligandlar ile hücre dışı proteinler için ortaya çıkmaya devam edin. İnsan etkileşimlerde reseptör-ligand ve model organizmalar tanımlama hücresel iletişim homeostazı yanı sıra hastalığı için önde gelen bozukluk sırasında dikte mekanizmaları anlamak ve bu nedenle yeni veya geliştirilmiş bilgilendirmek için önemlidir tedavi olanakları. Yine de, hücre dışı protein etkileşimler taraf?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Philamer Calses ve Kobe Yuen eleştirel yazı okumak için teşekkür ederiz. Biz mükemmel teknik danışmanlık için Randy Yen için müteşekkiriz.
Materials
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473 (2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction–the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
