Tecnología de microarrays de proteínas extracelulares para detección de alto rendimiento de las interacciones ligando-Receptor de baja afinidad

El método revisado aquí describe la impresión de una colección de proteínas extracelulares en un formato de microarrays, seguido de un método para la detección de un objetivo de interés contra esta biblioteca. Hemos identificado proteínas multimerization como un paso crucial para la detección de interacciones caracterizados por afinidades de unión baja. Para mejorar la detección de estas interacciones, se describe un protocolo basado en multimerization de la proteína de consulta de interés utilizando microesferas.

Segregada y superficie expresan proteínas de la célula (colectivamente llamadas proteínas extracelulares) junto con sus socios de la interacción son reguladores claves de la comunicación celular, la señalización y la interacción con el microambiente. Por lo tanto, son esenciales en la regulación de muchos procesos fisiológicos y patológicos. Aproximadamente un cuarto del genoma humano (≈5, 000 proteínas) codifica para las proteínas extracelulares, que, dada su relevancia y accesibilidad a medicamentos sistemáticamente entregados, representan objetivos claves para el desarrollo de drogas¹. Por lo tanto, proteínas extracelulares representan más del 70% de los objetivos de la proteína con acción farmacológica conocida de medicamentos aprobados en el mercado, conocido como el “proteoma druggable”. A pesar de su importancia y abundancia, las redes de interacción (ePPI) proteína extracelular siendo muy subrepresentadas en las bases de datos disponibles. Esto es fundamentalmente debido a la complejidad bioquímica de las proteínas extracelulares, que impide su caracterización utilizando tecnologías más disponibles². En primer lugar, las proteínas de membrana son difíciles de solubilizar, un proceso que implica a menudo las condiciones de lavado áspero y detergentes; en segundo lugar, proteínas extracelulares a menudo carecen de relevantes modificaciones post-traduccionales como glicosilación que están ausentes cuando estas proteínas se expresan en comúnmente utilizados sistemas heterólogos. Finalmente, las interacciones entre los receptores, tales como co receptores expresados en las células inmunes, suelen ser transitorios y caracterizado por afinidades muy bajo (K_D en el ~ 1 μM a > rango μM 100). En conjunto, la naturaleza de estas proteínas y su enlace de socios hacen más ampliamente utilizado tecnologías como afinidad purificación/espectrometría de masas (AP/MS) o levadura-dos-híbrido, inadecuado para la detección de interacciones en el espacio extracelular ^{2 , 3}.

En un esfuerzo por superar estos desafíos técnicos y acelerar el descubrimiento de nuevas interacciones de proteínas extracelulares, hemos desarrollado una cobertura alta proteína extracelular microarray^4,5. Microarrays ofrecen la ventaja de generar superficies de alta densidad con pequeñas cantidades de muestra y son generalmente susceptibles a estudios de alto rendimiento. Estudios basados en microarrays de la proteína anteriormente han proporcionado penetraciones relevantes en las interacciones de la proteína para varios organismos modelo, aunque centrándose principalmente en interacciones citosólicas o proteína específica familias^{6,7, 8}. Por el contrario, trabajo limitado se ha hecho para investigar las interacciones de la proteína extracelular utilizando esta tecnología. Hemos desarrollado un método de microarrays de proteínas para permitir estudios de ePPIs mediante la construcción de una biblioteca amplia y muy diversa de purificado proteínas secretadas y solo receptores transmembranales de (STM) expresan como recombinantes dominios extracelulares (ECD) fusionados a tags comunes para afinidad purificación⁴. El éxito de las pantallas de microarrays de la proteína depende en gran medida la creación de una biblioteca de proteína de alta calidad. Para la expresión de la proteína de la biblioteca y la consulta, células mamíferas o insectos fueron elegidos preferentemente como sistemas de expresión heteróloga, para asegurar la adecuada incorporación de modificaciones post-traduccionales como la glicosilación o disulfuro de bonos. SDS-PAGE, cromatografía por exclusión de tamaño y luz laser multi-angulo de dispersión son técnicas comúnmente utilizadas para evaluar la calidad de la proteína recombinante. La biblioteca de la proteína entonces es vista en diapositivas epoxysilane y almacenada a-20 ° C para uso a largo plazo. Concentraciones de proteína por encima de 0,4 mg/mL se recomiendan para el protocolo que se describe a continuación. Por lo tanto, baja expresando proteínas pueden requerir un paso de concentración antes de la impresión de la muestra y almacenamiento. Sin embargo, la principal ventaja de esta técnica es la escasa cantidad de proteína necesaria (50 μg de proteína es suficiente para llevar a cabo > 2.000 pantallas), junto con el consumo de proteínas de consulta mínima (20-25 μg por pantalla de duplicados). Utilizando el protocolo y el equipo descrito aquí, y siempre que las bibliotecas están disponibles, se pueden generar resultados para proteínas individuales de la consulta dentro de un día de trabajo.

Un desafío importante en la detección de interacciones de proteínas en el ambiente extracelular surge de su naturaleza característico débil o transitoria, que impide la identificación de metodologías más utilizadas. Aumentar la avidez de Unión grandemente mejora la sensibilidad para la detección de proteína débiles interacciones^9,10,11. Basado en este principio se desarrolló un método para multimerize las proteínas de la consulta (expresadas como Fc fusión) usando proteína de granos recubiertos A^4,5. Para evitar cualquier potencial inactivación de la proteína de la consulta por etiquetas al azar, en cambio etiqueta una irrelevante inmunoglobulina humana G con Cy5 y añadirlo junto con la proteína de la consulta a las perlas de proteína A, eliminando así cualquier artefactos debido a la conjugación directa de un colorante a la proteína de interés. Teniendo en cuenta las afinidades micromolar de varios pares de co-receptor, los complejos multivalentes mejoran relación señal a ruido, comparado con las proteínas de consulta de fusión Fc proyectadas como proteínas solubles⁴.

En Resumen, el objetivo de este protocolo es describir la preparación de microarray diapositivas que contiene una biblioteca de proteína extracelular preexistente para la identificación de las interacciones receptor-ligando. Repasamos los pasos para la diapositiva de la impresión, seguido de un protocolo para la detección de una proteína de interés contra la biblioteca de proteína extracelular. Por otra parte, se describe un método para la detección mejorada de ePPIs basados en microesferas para lograr mayor avidez de la proteína bajo estudio. La tecnología de microarrays de la proteína extracelular descrita aquí representa un enfoque rápido, robusto y eficaz para la investigación y detección de ePPI novela con baja proporción de falsos positivos y utilizando solamente cantidades de microgramos de la proteína de consulta bajo investigación. Esta tecnología ha impulsado varios estudios que han proporcionado penetraciones relevantes en funciones celulares desconocidas y vías de señalización para una variedad de receptores^12,13, incluyendo virales immunoregulators¹⁴, y pueden ser utilizados para la orphanize cualquier proteína extracelular de interés.