Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий

Метод, рассмотрели здесь описывает печать коллекции внеклеточных белков в формате microarray дна, а затем с помощью метода для проверки целевого интерес против этой библиотеки. Мы выявили белок multimerization как решающий шаг для обнаружения взаимодействий, характеризуются низкой привязки сродства. Для улучшения обнаружения этих взаимодействий, мы описываем протокол, основанный на multimerization запроса протеина интереса, используя микрошарики.

Выделяется и клеток выражена поверхности белки (собирательно именуются внеклеточные белки) наряду с их взаимодействия партнеров являются ключевые регуляторы сотовой связи, сигнализации и взаимодействия с микроокружения. Таким образом, они имеют важное значение в регуляции многих физиологических и патологических процессов. Около четверти генома человека (≈5, 000 белки) кодирует внеклеточных белков, который, учитывая их важность и доступность для систематически поставляемых наркотиков, представляют собой ключевые цели развития наркотиков¹. Следовательно внеклеточные белки представляют более чем 70% белковых мишеней с известных фармакологических действий для утвержденных лекарств на рынке, известный как «druggable протеом». Несмотря на их важность и изобилия внеклеточный протеин взаимодействия (ePPI) сетей по-прежнему удивительно недопредставлены в доступных баз данных. Это принципиально ввиду сложных биохимических внеклеточных белков, который исключает их характеристик с помощью самых доступных технологий². Во-первых мембранные белки трудны для того солюбилизировать последнего, процесс, который часто включает в себя тяжелые Стиральная условий и моющих средств; Во-вторых внеклеточные белки часто не хватает соответствующих столб-поступательные изменения таких как гликозилирования, отсутствуют когда эти белки выражаются в часто используемые гетерологичных систем. Наконец, взаимодействие между рецепторов, таких как сопредседатель рецепторов, выраженные на иммунные клетки, часто переходных и характеризуется очень низкой работоспособностью (_D K в ~ 1 мкм для > 100 мкм диапазон). В общей сложности характер этих белков и их привязки, которые партнеры оказывают наиболее широко используемых технологий, таких как сродства очищения/масс-спектрометрии (AP/МС) или дрожжи 2 гибрида, непригодных для обнаружения взаимодействий в пространстве внеклеточного ^{2 , 3}.

В попытке преодолеть эти технические проблемы и ускорить открытие новых взаимодействий для внеклеточных белков мы разработали высокий охват внеклеточный протеин microarray дна^4,5. Microarrays предлагают преимущество создания высокой плотности поверхности с небольшим количеством образца и обычно поддаются исследования высокой пропускной способности. Исследования на основе microarray протеина ранее предоставили соответствующие понимание взаимодействия протеина для нескольких модельных организмов, хотя главным образом на цитозольной взаимодействия или на конкретных белка семьи^{6,7, 8}. В отличие от ограниченных была проделана расследовать внеклеточный протеин взаимодействия с использованием этой технологии. Мы разработали метод microarray протеина для включения исследований ePPIs путем создания всеобъемлющего и весьма разнообразных библиотека очищенного секретируемые белки и одного трансмембранные рецепторы (СТМ) выражена как рекомбинантной внеклеточных доменов (ECD) сливается с общие теги для очищения сродства⁴. Успех на экранах microarray протеина опирается на создание высокого качества белка библиотеки. Для выражения запроса, так и библиотека белка mammalian клетки или клетки, насекомых преференциально были выбраны как гетерологичных выражение системы, для обеспечения правильного сложения столб-поступательные изменения таких облигаций гликозилирования или дисульфида. SDS-PAGE, размер гель-проникающей хроматографии и мульти-угол лазерного рассеяния света являются методы обычно используются для оценки качества рекомбинантных белков. Белка библиотека затем увидел на epoxysilane слайды и температуре-20 ° C для долгосрочного использования. Концентрация белка выше 0,4 мг/мл рекомендуются для протокола, описанных ниже. Таким образом низкий выражая белков может потребовать концентрации шаг до печати выборки и хранения. Тем не менее, основным преимуществом этого метода является небольшой объем белка требуется (50 мкг белка достаточно выполнить > 2000 экраны), наряду с минимальным запроса потребление белка (20-25 мкг за дубликаты экран). С использованием протокола и оборудования описано здесь, и если имеются библиотеки, результаты для отдельных запросов белки могут быть получены в течение одного рабочего дня.

Одной из основных задач при выявлении взаимодействий протеина в внеклеточных среды вытекает из их характерно слабое или временный характер, что исключает возможность идентификации, наиболее часто используемых методологий. Расширения привязки алчность значительно улучшает чувствительность для обнаружения слабых белковых взаимодействий^9,10,11. Основываясь на этом принципе, мы разработали метод multimerize запроса белки (выражается как ФК fusion) с помощью белка A-покрытием бусины^4,5. Чтобы избежать любой потенциальной инактивации белка запроса путем случайных маркировки, мы вместо этого метка не значения человеческого иммуноглобулина G с Cy5 и добавить его вместе с запроса белка белка А бусы, таким образом устраняя любые артефакты из-за прямого сопряжения краситель для протеина интереса. С учетом всех сходство несколько пар ко-рецептор, разносторонним комплексы значительно повысить соотношение сигнал-шум, по сравнению с Fc фьюжн запросов белки показан как растворимые белки⁴.

Таким образом цель настоящего Протокола является описать подготовку microarray слайды, содержащий существующие библиотеки внеклеточный протеин для идентификации рецептор лиганд взаимодействий. Мы рассмотрим шаги, необходимые для печати, а затем протокол для скрининга протеина интереса против внеклеточных белков библиотеки слайдов. Кроме того мы описываем метод расширения обнаружения ePPIs на основании микрошарики для достижения увеличения алчность белка изучается. Описанная здесь технология microarray внеклеточный протеин представляет собой быстрый, надежный и эффективный подход для скрининга и выявления роман ePPI с низким коэффициентом ложно положительных и, используя только микрограмм количеств белка запроса под расследование. Эта технология подпитывается несколько исследований, которые предоставили соответствующие взглянуть на ранее неизвестных клеточных функций и сигнальных путей для различных рецепторов^12,13, включая вирусный immunoregulators¹⁴, и может быть использован для снятия orphanize любой внеклеточный протеин интереса.