Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

O método aqui analisado descreve a impressão de uma coleção de proteínas extracelulares em um formato de microarray, seguido por um método para a seleção de um alvo de interesse com esta biblioteca. Nós identificamos proteínas multimerization como um passo crucial para a deteção de interações caracterizada por afinidades de ligação baixa. Para realçar a deteção dessas interações, descrevemos um protocolo baseado em multimerization da proteína de interesse usando microbeads consulta.

Segregada e célula superfície-expresso proteínas (coletivamente denominadas proteínas extracelulares) juntamente com seus parceiros de interação são reguladores chaves da comunicação celular, sinalização e interação com o microambiente. Eles são, portanto, essenciais na regulação de muitos processos fisiológicos e patológicos. Aproximadamente um quarto do genoma humano (≈5, 000 proteínas) codifica para proteínas extracelulares, que, dado o seu significado e acessibilidade às drogas sistematicamente entregues, representam os principais alvos para o desenvolvimento de drogas¹. Consequentemente, as proteínas extracellular representam mais de 70% das metas de proteína com ação farmacológica conhecido por drogas aprovadas no mercado, conhecido como o “proteome druggable”. Apesar da sua importância e abundância, as redes de interação (ePPI) da proteína-proteína extracelular permanecem notavelmente sub-representados nos bancos de dados disponíveis. Isto é, fundamentalmente, devido à natureza complexa bioquímica das proteínas extracelulares, que impede a sua caracterização usando mais disponíveis tecnologias². Em primeiro lugar, as proteínas de membrana são difíceis de solubilizar, um processo que muitas vezes envolve lavagem duras condições e detergentes; em segundo lugar, as proteínas extracellular faltam frequentemente relevantes modificações borne-translational como glicosilação que estão ausentes quando estas proteínas são expressas em comumente utilizados sistemas heterólogos. Finalmente, interações entre receptores, tais como co receptores expressados em células do sistema imunológico, são muitas vezes transitórios e caracterizada por afinidades muito baixas (K_D no ~ 1 μM para > intervalo de 100 μM). No total, a natureza destas proteínas e sua vinculação parceiros processam mais amplamente utilizadas tecnologias, tais como espectrometria de massa/purificação de afinidade (AP/MS) ou fermento-dois-híbrido, impróprio para a deteção das interações no espaço extracelular ^{2 , 3}.

Em um esforço para superar esses desafios técnicos e acelerar a descoberta de novas interações para proteínas extracelulares, desenvolvemos uma cobertura alta proteína extracelular microarray^4,5. Microarrays oferecem a vantagem de gerar superfícies de alta densidade com pequenas quantidades de amostra e são geralmente favoráveis aos estudos de alto rendimento. Proteína microarray baseado em estudos anteriormente forneceu insights relevantes sobre interações da proteína por vários organismos-modelo, embora concentrando-se principalmente no citosol interações ou na proteína específica famílias^{6,7, 8}. Em contraste, limitado de trabalho tem sido feito para investigar interações de proteínas extracelulares usando esta tecnologia. Nós desenvolvemos um método de microarray da proteína para permitir estudos de ePPIs através da construção de uma biblioteca abrangente e altamente diversa de proteínas purified segregadas e único receptores transmembranares de (STM) expressaram como recombinação domínios extracelulares (ECD) fundidos a tags comuns para afinidade purificação⁴. O sucesso das telas do microarray da proteína baseia-se fortemente sobre a criação de uma biblioteca de proteína de alta qualidade. Para a expressão da proteína de biblioteca e consulta, nas células de mamíferos ou insetos foram preferencialmente escolhidos como sistemas de expressão heteróloga, para garantir a adequada adição de modificações borne-translational como glicosilação ou dissulfureto de títulos. SDS-PAGE, cromatografia de exclusão e espalhamento de luz laser de multi-ângulo são técnicas comumente utilizadas para avaliar a qualidade da proteína recombinante. A biblioteca de proteína é então manchada em epoxysilane slides e armazenada a-20 ° C para uso a longo prazo. As concentrações de proteína acima de 0,4 mg/mL são recomendadas para o protocolo descrito abaixo. Portanto, baixa-expressando proteínas podem exigir uma etapa de concentração antes da impressão de amostra e armazenamento. No entanto, a principal vantagem desta técnica é o pequeno volume de proteína necessária (50 μg de proteína é suficiente para executar > 2.000 telas), juntamente com o consumo de proteína de consulta mínima (20-25 μg por tela de duplicatas). Usando o protocolo e o equipamento descrito aqui, e desde que as bibliotecas estão disponíveis, resultados para proteínas de consultas individuais podem ser gerados dentro de um dia de trabalho.

Um grande desafio na detecção de interações da proteína no meio extracelular decorre sua natureza caracteristicamente fraca ou transitória, que impede a identificação por metodologias mais comumente usadas. A avidez de vinculação a aumentar grandemente melhora a sensibilidade para a deteção de proteínas fracas interações^9,10,11. Baseado neste princípio que desenvolvemos um método para multimerize as proteínas de consulta (expressadas como fusão Fc) usando a proteína grânulos revestidos A^4,5. Para evitar qualquer potencial inactivação da proteína consulta pela rotulagem aleatória, nós em vez disso rotular uma irrelevante a imunoglobulina humana G com Cy5 e adicioná-lo juntamente com a proteína de consulta para os grânulos de proteína A, eliminando assim qualquer artefatos devido a conjugação direta de um tintura à proteína de interesse. Tendo em conta as afinidades micromolar de vários pares de co do receptor, os complexos multivalentes aumentar consideravelmente o sinal à relação de ruído, em comparação com proteínas da consulta Fc-fusão selecionadas como proteínas solúveis⁴.

Em resumo, o objetivo do presente protocolo é descrever a preparação de microarray slides contendo uma biblioteca de proteína extracelular pré-existentes para identificação de interações ligante-receptor. Revemos as etapas para slide, impressão, seguido por um protocolo para a seleção de uma proteína de interesse contra a biblioteca de proteína extracelular. Além disso, descrevemos um método para a detecção avançada de ePPIs baseada microbeads para alcançar maior avidez da proteína em estudo. A tecnologia de microarray de proteína extracelular descrita aqui representa uma abordagem rápida, robusta e eficaz para a seleção e detectando ePPI romance com baixos índices de falso-positivos e utilizando apenas as quantidades de microgramas da proteína sob consulta investigação. Esta tecnologia tem alimentado vários estudos que forneceram insights relevantes sobre previamente desconhecida de funções celulares e vias de sinalização para uma variedade de receptores^12,13, incluindo immunoregulators viral¹⁴, e pode ser utilizado para orphanize de qualquer extracelular da proteína de interesse.