Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Il metodo Recensito qui descrive la stampa di un insieme di proteine extracellulari in un formato di microarray, seguita da un metodo per lo screening di un target di interesse nei confronti di questa libreria. Abbiamo identificato multimerization proteina come un passo fondamentale per il rilevamento delle interazioni caratterizzate da affinità di legame basso. Per migliorare la rilevazione di queste interazioni, descriviamo un protocollo basato su multimerization della proteina di interesse utilizzando microsfere query.

Secreto e superficie-espresse proteine della cellula (collettivamente denominate proteine extracellulari) insieme ai loro partner interagenti sono regolatori chiave della comunicazione cellulare, di segnalazione e di interazione con il microambiente. Essi sono, pertanto, essenziale nella regolazione di molti processi fisiologici e patologici. Circa un quarto del genoma umano (≈5, 000 proteine) codifica per proteine extracellulari, che, dato il loro significato e accessibilità ai farmaci sistematicamente consegnati, rappresentano obiettivi chiave per droga sviluppo¹. Di conseguenza, proteine extracellulari rappresentano oltre il 70% degli obiettivi della proteina con azione farmacologica nota per farmaci approvati sul mercato, conosciuto come il “proteoma trattabili”. Nonostante la loro importanza e l’abbondanza, le reti di interazione (ePPI) extracellulare della proteina-proteina rimangono notevolmente sottorappresentate nei database disponibili. Questo è fondamentalmente a causa della natura complessa biochimica delle proteine extracellulari, che preclude loro caratterizzazione utilizzando tecnologie più disponibile². In primo luogo, le proteine di membrana sono difficili da solubilizzare, un processo che coinvolge spesso condizioni di lavaggio difficili e detergenti; in secondo luogo, le proteine extracellulari spesso mancano rilevanti modificazioni post-traduzionali come glicosilazione che sono assenti quando queste proteine sono espresse in comunemente utilizzati sistemi eterologhi. Infine, interazioni tra recettori, quali co-recettori espressi sulle cellule immuni, sono spesso transitori e caratterizzate da bassissima affinità (K_D nel μM ~ 1 a > 100 gamma μM). Complessivamente, la natura di queste proteine e la loro associazione partner di rendering più ampiamente utilizzate tecnologie quali la spettrometria di massa/purificazione di affinità (AP/MS) o lievito-due-ibrido, inadatto per il rilevamento delle interazioni nello spazio extracellulare ^{2 , 3}.

Nel tentativo di superare queste sfide tecniche e accelerare la scoperta di nuove interazioni per proteine extracellulari, abbiamo sviluppato una copertura alta proteina extracellulare microarray^4,5. I microarrays offrono il vantaggio di generare superfici ad alta densità con piccole quantità di campione e sono generalmente favorevoli agli studi elevato throughput. Studi basati su microarray di proteine precedentemente hanno fornito le comprensioni pertinenti in interazioni proteina per diversi organismi di modello, pur concentrandosi principalmente su interazioni citosolici o proteina specifica famiglie^{6,7, 8}. Al contrario, limitati del lavoro è stato fatto per indagare le interazioni proteina extracellulare utilizzando questa tecnologia. Abbiamo sviluppato un metodo di microarray della proteina per attivare studi di ePPIs con la costruzione di una biblioteca completa e altamente diversificata di proteine secrete purificate e singola transmembrana (STM) recettori espressi come ricombinante domini extracellulari (ECD) fusi a comune tag per purificazione di affinità⁴. Il successo delle schermate di microarray di proteine si basa molto sull’istituzione di una biblioteca di proteine di alta qualità. Per l’espressione della proteina la biblioteca e la query, cellule di mammiferi o cellule di insetto preferenzialmente furono scelti come sistemi di espressione eterologa, per garantire la corretta aggiunta di modifiche post-traduzionali quali obbligazioni glicosilazione o bisolfuro. SDS-PAGE, cromatografia di esclusione di formato e diffusione della luce laser multi-angolo sono tecniche comunemente utilizzate per valutare la qualità delle proteine ricombinanti. La libreria di proteina è quindi individuata sui vetrini epoxysilane e conservata a-20 ° C per uso a lungo termine. Le concentrazioni di proteina di sopra di 0,4 mg/mL sono raccomandate per il protocollo descritto di seguito. Pertanto, basso-esprimere proteine possono richiedere un passaggio di concentrazione prima della stampa del campione e deposito. Tuttavia, un vantaggio principale di questa tecnica è la bassa quantità di proteina necessaria (50 μg di proteina è sufficiente effettuare > 2.000 schermi), al fianco di consumo di proteine minimo query (20-25 μg / schermo duplicati). Utilizzando il protocollo e le apparecchiature descritte qui, e purché le librerie siano disponibili, possono essere generati risultati per proteine singole query entro un giorno lavorativo.

Una sfida importante nella rilevazione di interazioni della proteina nell’ambiente extracellulare nasce dalla loro natura tipicamente transitoria o debole, che preclude l’identificazione di metodologie più comunemente utilizzati. Aumentando notevolmente l’avidità di legame, migliora la sensibilità per la rilevazione di proteine deboli interazioni^9,10,11. Basato su questo principio abbiamo sviluppato un metodo per multimerize le proteine di query (espresse come fusione Fc) utilizzando proteine perline rivestite su A^4,5. Per evitare qualsiasi potenziale inattivazione della proteina query di contrassegno casuale, abbiamo invece etichettare un’immunoglobulina umana irrilevante G con Cy5 e aggiungerlo insieme con la proteina di query per le perle di proteina A, eliminando così eventuali artefatti a causa la coniugazione diretta di un colorante per la proteina di interesse. Dato le affinità micromolari di diverse coppie di co-recettore, i complessi multivalenti migliorare notevolmente il rapporto segnale-rumore, rispetto alle proteine di query Fc-fusione proiettati come proteine solubili⁴.

In sintesi, l’obiettivo del presente protocollo è di descrivere la preparazione dei vetrini di microarray contenente una libreria di proteina extracellulare pre-esistenti per l’identificazione delle interazioni recettore-ligando. Esaminiamo i passaggi per slide stampa, seguita da un protocollo per lo screening di una proteina di interesse contro la libreria di proteina extracellulare. Inoltre, descriviamo un metodo per migliorare il rilevamento di ePPIs basato su microsfere per raggiungere una maggiore avidità della proteina in esame. La tecnologia di microarray della proteina extracellulare qui descritta rappresenta un approccio veloce, affidabile ed efficace per lo screening e la rilevazione ePPI romanzo con bassi rapporti di falsi positivi e utilizzando solo quantità di microgrammo della proteina query sotto indagine. Questa tecnologia ha alimentato gli studi multipli che hanno fornito le comprensioni pertinenti in funzioni cellulari precedentemente sconosciute e vie di segnalazione per una varietà di recettori^12,13, inclusi virali immunoregulators¹⁴, e possono essere utilizzate per-orphanize qualsiasi extracellulare della proteina di interesse.