חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.
Abstract
גורמים המופרש, קולטני ממברנה-קשורה ושותפים שמעצבת את הרגולטורים העיקריים של התקשורת הסלולארית. והתחלה איתות cascades במהלך הומאוסטזיס ומחלות, וככזה מייצגים עיקרי מטרות טיפוליות. למרות הרלוונטיות שלהם, רשתות אינטראקציה אלה נותרו באופן משמעותי underrepresented במסדי הנתונים הנוכחי; לכן, ביותר חוץ-תאית חלבונים שיהיה אין שותף מחייב מתועדת. חוסר התאמה זה נובע בעיקר האתגרים הקשורים בחקר החלבונים חוץ-תאית, כולל ביטוי של חלבונים פונקציונליים, ואינטראקציות בזיקה חלש, נמוך, חלבון שנוצר לעיתים קרובות בין קולטני פני שטח התא. מטרת שיטה זו היא לתאר את הדפסת ספריה של חלבונים חוץ-תאית בתבנית microarray להקרנה של אינטראקציות חלבון-חלבון. כדי לאפשר זיהוי של אינטראקציות חלשות, מתוארת שיטה המבוססת על multimerization של החלבון שאילתה שנבחנה. מצמידים לגישה זו מבוססת על microbead multimerization על multivalency מוגברת, microarray חלבון מאפשרת זיהוי חזקים של אינטראקציות חלבון ארעי תפוקה גבוהה. שיטה זו מציעה מדגם מהיר ונמוך לצרוך-גישה לזיהוי של אינטראקציות חדשות החלות על כל חלבון חוץ-תאית. חלבון microarray הדפסה וסינון פרוטוקול מתוארים. טכנולוגיה זו תהיה שימושית עבור חוקרים המבקשים שיטה חזקה של גילוי של אינטראקציות חלבון בחלל חוץ-תאית.
Introduction
השיטה שנסקרו כאן מתאר ההדפסה של אוסף של חלבונים חוץ-תאית בתבנית microarray, ואחריו שיטה להקרנה של מטרה עניין נגד בספריה זו. זיהינו את החלבון multimerization כצעד מכריע לצורך זיהוי של אינטראקציות מאופיין על ידי איגוד נמוך הזיקות. כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות אלה, אנו מתארים פרוטוקול מבוסס על multimerization של החלבון שאילתה עניין באמצעות גרגרי.
מופרש, תא השטח הביע חלבונים (הנקרא באופן קולקטיבי חלבונים חוץ-תאית) יחד עם שותפים שמעצבת את הרגולטורים מפתח תקשורת סלולרית, איתות ואינטראקציה עם microenvironment. הם חיוניים, לכן, בוויסות תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים. בערך רבע של הגנום האנושי (≈5, 000 חלבונים) מקודד חלבונים חוץ-תאית, אשר, בהתחשב שלהם משמעות, נגישות לתרופות מועברות באופן שיטתי, מייצגים מטרות המפתח עבור פיתוח תרופה1. כתוצאה מכך, חוץ-תאית חלבונים מייצגים יותר מ 70% של המטרות חלבון עם פעולה תרופתי ידוע עבור תרופות שאושרו על השוק, המכונה “פרוטאום druggable”. למרות החשיבות שלהם, שפע, הרשתות אינטראקציה (אפי) חלבון חוץ-תאית נשארים להפליא underrepresented במסדי הנתונים הזמינים. . זאת באופן מהותי בשל האופי הביוכימי המורכב של החלבונים חוץ-תאית, שמונע את האפיון שלהם באמצעות טכנולוגיות הזמינה ביותר2… ראשית, קרום חלבונים קשים solubilize, תהליך זה כרוך לעתים קרובות תנאים קשים כביסה וחומרי ניקוי; שנית, חלבונים חוץ-תאית לעתים קרובות חוסר שינויים post-translational רלוונטי כגון גליקוזילציה כי הם נעדרים כאשר חלבונים אלה באים לידי ביטוי נפוץ המשמש במערכות heterologous. בסופו של דבר, אינטראקציות בין רצפטורים, כגון קולטנים לעבודה הביעו על תאים חיסוניים, הם לעיתים קרובות ארעי, המאופיינת הזיקות נמוך מאוד (KD μM ~ 1 ל > 100 μM טווח). בסך הכל, הטבע של חלבונים אלה ואיגוד שלהם שותפים רינדור נרחב ביותר מנוצל טכנולוגיות, כגון זיקה טיהור/ספקטרומטריית (AP/MS) או שמרים-שני-היברידית, מתאימים לצורך זיהוי של אינטראקציות במרחב חוץ-תאית 2 , 3.
בניסיון להתגבר על אתגרים טכניים אלה ולהאיץ את הגילוי של אינטראקציות הרומן חלבונים חוץ-תאית, פיתחנו4,5microarray חלבון חוץ-תאית כיסוי גבוהה. מיקרו-מערכים מציעים את היתרון של יצירת משטחים בצפיפות גבוהה עם כמויות קטנות של המדגם, נתונות בדרך כלל מחקרים תפוקה גבוהה. חלבון מבוססי microarray מחקרים בעבר סיפקו תובנות רלוונטיות אינטראקציות חלבון עבור אורגניזמים מספר דגם, אמנם בעיקר תוך התמקדות על אינטראקציות cytosolic או חלבון ספציפי משפחות6,7, 8. לעומת זאת, עבודה מוגבל סיים לחקור אינטראקציות חלבון חוץ-תאית באמצעות טכנולוגיה זו. פיתחנו שיטה microarray חלבון כדי לאפשר מחקרים של ePPIs על ידי בניית ספרייה מקיפה ומגוונת מאוד של חלבונים מטוהרים המופרש והביע קולטנים (STM) transmembrane יחיד רקומביננטי כמו תחומים חוץ-תאית (ECD) מחובר לגבו תגיות נפוצות עבור טיהור זיקה4. ההצלחה של המסכים microarray חלבון מתבסס בעיקר על הקמת ספריה חלבון באיכות גבוהה. ביטוי של חלבון ספריית והן השאילתה, בתרבית של תאים או תאים חרקים מעדיפים נבחרו כמערכות ביטוי heterologous, כדי להבטיח תוספת נכונה של שינויים post-translational כגון אגרות חוב גליקוזילציה או disulphide. מרחביות-דף, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה, אור לייזר רב זווית פיזור הן טכניקות נפוצות מנוצל כדי להעריך את איכות חלבון רקומביננטי. הספרייה חלבון הוא הבחין על גבי שקופיות epoxysilane ואז ומאוחסנים ב-20 ° C לשימוש ארוך טווח. ריכוז חלבון מעל 0.4 מ”ג/מ”ל מומלצים עבור פרוטוקול המתואר להלן. לכן, נמוך-ביטוי חלבונים עשויה לדרוש צעד ריכוז לפני הדפסת דוגמת ואחסון. למרות זאת, יתרון הראשי של טכניקה זו הוא נפח קטן של החלבון הנדרש (μg 50 של חלבון מספיקה לבצע > מסכי 2,000), לצד צריכת חלבון שאילתה מינימלי (20-25 μg לכל מסך כפילויות). באמצעות פרוטוקול הציוד שמתואר כאן, בתנאי ספריות זמינים, ניתן להפיק תוצאות השאילתה בודדים חלבונים תוך יום עבודה אחד.
האתגר העיקרי באיתור אינטראקציות חלבון בסביבה חוץ-תאית נובע טבעם כאופייני חלש או ארעית, שמונע את זיהוי באמצעות מתודולוגיות הנפוצות ביותר. הגדלת ובצמא מחייב את מאוד משפר את הרגישות לגילוי חלבון חלש אינטראקציות9,10,11. מבוסס על עיקרון זה פיתחנו שיטה כדי multimerize את החלבונים שאילתה (המבוטא פיוז’ן Fc) באמצעות חלבון חרוזים מצופים A4,5. כדי למנוע כל איון פוטנציאלי של החלבון שאילתה על-ידי תיוג אקראי, אנחנו במקום תווית לא רלוונטית האנושי בנוגדנים G עם Cy5 ולהוסיף אותו יחד עם החלבון השאילתה החרוזים חלבון א’, וכך למנוע פריטים בשל הבניין ישירה של לצבוע את החלבון עניין. בהתחשב את הזיקות micromolar של מספר זוגות קולטן שיתוף, מתחמי multivalent מאוד לשפר את האות לרעש יחס, לעומת Fc-fusion שאילתה חלבונים מוקרן חלבונים מסיסים4.
לסיכום, המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את הכנת שקופיות microarray המכיל ספריה חלבון חוץ-תאית קיימים עבור זיהוי של קולטן-ליגנד אינטראקציות. אנו בודקים את השלבים עבור שקופית הדפסה, ואחריו פרוטוקול להקרנה של חלבון עניין נגד הספרייה חלבון חוץ-תאית. יתר על כן, אנו מתארים שיטה לגילוי משופרת של ePPIs מבוסס על גרגרי להשגת ובצמא מוגברת של החלבון שנבחנה. חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה microarray המתוארים כאן מייצג גישה מהירה, עמיד ויעיל של ההקרנה וכן זיהוי אפי הרומן עם יחס חיובי-false נמוכה, על ידי ניצול מיקרוגרם בלבד, כמויות החלבון השאילתה תחת החקירה. טכנולוגיה זו הניע מחקרים רבים שסיפקו תובנות רלוונטיות תאיים לא מוכרת, איתות המסלולים למגוון רחב של קולטנים12,13, לרבות נגיפי immunoregulators14, יכול להיות מנוצל כדי לבטל את orphanize חלבון חוץ-תאית בכל עניין.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר משמעותי של קולטנים יתומה הגנום האנושי ו הרומן שותפים שמעצבת להמשיך להופיע חלבונים חוץ-תאית עם ליגנדים מאופיין בעבר. הגדרת קשרי הגומלין ליגנד לקולטן של האדם ואורגניזמים דגם חיוני להבין את המנגנונים מכתיב תקשורת סלולרית במהלך הומאוסטזיס, וכן dysregulation למחלות, ולהודיע לכן חדשות או משופר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Philamer Calses, קובי יואן על באורח קשה לקרוא את כתב היד. . אנחנו אסירי תודה רנדי ין לקבלת עצה טכנית מצוינת.
Materials
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473 (2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction–the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
