Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Die Methode überprüft hier beschreibt das Drucken aus einer Sammlung von extrazellulären Proteine in einem Microarray-Format, gefolgt von einer Methode für das Screening eines Ziels des Interesses gegen diese Bibliothek. Wir haben als ein entscheidender Schritt für die Erkennung von Interaktionen gekennzeichnet durch niedrige verbindliche Affinitäten Protein Multimerization identifiziert. Zur Erkennung dieser Interaktionen zu verbessern, beschreiben wir ein Protokoll basiert auf Multimerization der Abfrage-Proteins des Interesses mit Microbeads.

Sezerniert und Oberfläche ausgedrückt Zellproteinen (kollektiv extrazellulären Proteine genannt) zusammen mit ihren Interaktionspartnern sind wichtige Regulatoren des Mobilfunkes, Signalisierung und Interaktion mit der Mikroumgebung. Sie sind daher unerlässlich bei der Regulierung der vielen physiologischer und pathologischer Prozessen. Etwa ein Viertel des menschlichen Genoms (≈5, 000 Proteine) für extrazelluläre Proteine kodiert, die aufgrund ihrer Bedeutung und Zugänglichkeit systematisch gelieferten Medikamente, wesentliche Ziele für Droge-Entwicklung-¹vertreten. Folglich stellen extrazellulären Proteine mehr als 70 % der Protein-Targets mit bekannten pharmakologischen Wirkung für zugelassene Medikamente auf dem Markt, bekannt als das “druggable Proteom”. Trotz ihrer Bedeutung und Fülle bleiben die extrazelluläre Protein-Protein Interaktion (ePPI) Netze auffallend unterrepräsentiert in den verfügbaren Datenbanken. Dies ist grundsätzlich aufgrund der komplexen biochemischen Natur der extrazellulären Proteine, die deren Charakterisierung mit den meisten verfügbaren Technologien²ausschließt. Erstens sind Membranproteine schwer zu lösen, einen Prozess, der oft harten waschen Bedingungen und Reinigungsmittel beinhaltet; Zweitens fehlt extrazellulären Proteine häufig relevanten post-translationalen Modifikationen wie Glykosylierung, die fehlen, wenn diese Proteine in allgemein ausgedrückt werden heterologe Systemen verwendet. Schließlich, Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren, wie Co-Rezeptoren auf Immunzellen, ausgedrückt sind oft vorübergehend und zeichnet sich durch sehr niedrige Affinitäten (K-_D in ~ 1 μM bis > 100 μM-Bereich). Insgesamt verwendet die Natur dieser Proteine und deren Bindung, die am weitesten verbreitete Partner erbringen Technologien wie Affinität Reinigung/Massenspektrometrie (AP/MS) oder Hefe-zwei-Hybrid, ungeeignet für die Erkennung von Interaktionen in den Extrazellulärraum ^{2 , 3}.

In dem Bemühen, diese technische Herausforderungen zu meistern und beschleunigen die Entdeckung neuartiger Interaktionen für extrazelluläre Proteine entwickelten wir eine hohe Abdeckung extrazelluläre Protein Microarray^4,5. Microarrays bieten den Vorteil hoher Dichte Oberflächen mit kleinen Probenmengen zu erzeugen und sind in der Regel für Hochdurchsatz Studien zugänglich. Protein Microarray-basierte Studien haben bereits relevante Einblicke in Protein-Interaktionen für mehrere Modellorganismen vorgesehen, allerdings mit Schwerpunkt vor allem auf cytosolischen Interaktionen oder spezifisches Protein Familien^{6,7, 8}. Im Gegensatz dazu hat begrenzte gearbeitet um extrazelluläre Protein-Interaktionen mit dieser Technologie zu untersuchen. Haben wir eine Protein Microarray Methode zum Studium der ePPIs ermöglichen durch den Aufbau einer umfassenden und vielseitigen Bibliothek der gereinigten sekretierten Proteine und einzelne transmembrane (STM) Rezeptoren ausgedrückt als rekombinante extrazelluläre Domänen (ECD) verschmolzen häufige Tags für Affinität Reinigung⁴. Der Erfolg der Protein-Microarray-Bildschirme stützt sich auf die Schaffung einer qualitativ hochwertigen Protein-Bibliothek. Für den Ausdruck von der Bibliothek und die Abfrage Protein wurden Säugerzellen oder Insektenzellen bevorzugt als heterologe Expressionssysteme gewählt um richtige Zugabe von post-translationalen Modifikationen wie Glykosylierung oder umgeformt Anleihen sicherzustellen. SDS-PAGE, Größe Ausgrenzung Chromatographie und Laser Multiwinkel Lichtstreuung sind Techniken häufig genutzt, um rekombinante Proteinqualität zu bewerten. Die Protein-Bibliothek ist dann auf Epoxysilane Dias gesichtet und bei-20 ° C für die langfristige Nutzung gespeichert. Proteinkonzentrationen oberhalb von 0,4 mg/mL sind für die nachfolgend beschriebenen Protokoll empfohlen. Daher erfordern niedrig exprimierenden Proteine einen Konzentration Schritt vor der Probe drucken und speichern. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik ist jedoch das geringe Volumen des Proteins erforderlich (50 μg des Proteins ist ausreichend, um ausführen > 2.000 Bildschirme), neben minimalen Abfrage Proteinkonsum (20-25 μg pro Duplikate Bildschirm). Mit dem Protokoll und Ausrüstung hier beschrieben und Bibliotheken zur Verfügung gestellt, können Ergebnisse für Einzelabfrage Proteine erzeugt werden, innerhalb eines Arbeitstages.

Eine große Herausforderung bei der Aufdeckung von Protein-Interaktionen in der extrazellulären Umgebung ergibt sich aus ihrer charakteristisch schwach oder vorübergehender Natur, die Identifizierung durch die am häufigsten verwendeten Methoden ausschließt. Erhöhung der verbindlichen Avidity stark verbessert Empfindlichkeit zur Erkennung von schwachen Protein Interaktionen^9,10,11. Basierend auf diesem Prinzip wir entwickelten eine Methode, um Multimerize die Abfrage-Proteine (ausgedrückt als Fc Fusion) mit Protein A-beschichtete Perlen^4,5. Um jede mögliche Inaktivierung des Abfrage-Proteins durch zufällige Kennzeichnung zu vermeiden, wir stattdessen eine irrelevante menschliche Immunglobulin G mit Cy5 beschriften und fügen Sie es zusammen mit dem Abfrage-Protein Protein A-Perlen, wodurch Artefakte aufgrund der direkten Konjugation von einem Färben Sie, das Protein des Interesses. Angesichts der mikromolaren Affinitäten von mehreren Paaren Ko-Rezeptor, verbessern die multivalente Anlagen stark Signal-Rausch-Verhältnis, im Vergleich zu Fc-Abfrage Fusionsproteine als lösliche Proteine⁴gezeigt.

Zusammenfassend lässt sich sagen ist das Ziel dieses Protokolls, die Vorbereitung der Microarray-Folien mit einer vorbestehenden extrazelluläre Protein Bibliothek zur Identifizierung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu beschreiben. Wir überprüfen die Schritte für die Folie drucken, gefolgt von einem Protokoll für das Screening von einem Protein des Interesses gegen die extrazelluläre Protein-Bibliothek. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode für die erweiterte Erkennung von ePPIs basierend auf Microbeads erhöhte Avidität des Proteins unter Studie zu erreichen. Die hier beschriebenen extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie stellt einen schnellen, robusten und effektiven Ansatz für screening und Erkennung von neuartigen ePPI mit niedrige False-Positive-Verhältnisse und durch die einzige Mikrogramm Mengen des Proteins Abfrage unter Verwendung Untersuchung. Diese Technologie hat mehrere Studien angeheizt, die relevante Einblicke in bisher unbekannte Zellfunktionen und Signalwege für eine Vielzahl von Rezeptoren^12,13, darunter virale Immunoregulators¹⁴zur Verfügung gestellt haben, und kann genutzt werden, um eine extrazelluläre Protein des Interesses de-orphanize.