Technologie des microréseaux protéine extracellulaire pour détection haut débit des Interactions Ligand-récepteur de faible affinité

La méthode examinée ici décrit l’impression d’une collection de protéines extracellulaires dans un format « microarray », suivie d’une méthode de dépistage d’une cible d’intérêt contre cette bibliothèque. Nous avons identifié des protéines multimerization comme une étape cruciale pour la détection des interactions caractérisées par affinités de liaison faible. Pour améliorer la détection de ces interactions, les auteurs décrivent un protocole basé sur multimerization de la protéine de requête d’intérêt à l’aide de microbilles.

Sécrétée et cell surface protéines exprimées (collectivement appelées protéines extracellulaires) ainsi que leurs partenaires d’interactions sont des régulateurs clés de communication cellulaire, la signalisation et l’interaction avec le microenvironnement. Ils sont, par conséquent, essentiels dans la régulation de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Environ un quart du génome humain (≈5, 000 protéines) codant pour des protéines extracellulaires, qui, compte tenu de leur importance et leur accessibilité aux médicaments systématiquement livrées, représentent des cibles clés pour drogues développement¹. En conséquence, les protéines extracellulaires représentent plus de 70 % des cibles protéiques avec action pharmacologique connue pour des médicaments homologués sur le marché, connu comme le « proteome thérapeutiques ». Malgré leur importance et leur abondance, les réseaux d’interaction (ePPI) extracellulaire protéines restent remarquablement sous-représentées dans les bases de données disponibles. Il s’agit fondamentalement en raison de la complexité biochimique des protéines extracellulaires, qui s’oppose à leur caractérisation à l’aide de technologies plus disponible². Tout d’abord, les protéines membranaires sont difficiles à solubiliser, un processus qui comporte souvent des conditions de lavage dure et détergents ; Deuxièmement, protéines extracellulaires manquent souvent des modifications post-traductionnelles telles que glycosylation qui sont absents lorsque ces protéines sont exprimées en couramment utilisées systèmes hétérologues. Enfin, les interactions entre les récepteurs comme corécepteurs exprimées sur les cellules immunitaires, sont souvent transitoires et caractérisé par une très faible affinité (K_D dans le ~ 1 μM à > 100 gamme μM). Au total, la nature de ces protéines et leur liaison partenaires rendent plus largement utilisé des technologies, telles que l’affinité purification/spectrométrie de masse (AP/MS) ou levure-double-hybride, impropre à la détection des interactions dans l’espace extracellulaire ^{2 , 3}.

Dans le but de relever ces défis techniques et d’accélérer la découverte de nouvelles interactions des protéines extracellulaires, nous avons développé une couverture élevée protéines extracellulaires microarray^4,5. Microarrays offrent l’avantage de générer des surfaces à haute densité avec de petites quantités d’échantillon et généralement se prêtent à des études de haut débit. Études de puces de protéine fournis précédemment pertinentes aperçus des interactions de protéine pour plusieurs organismes modèles, quoique se concentrant principalement sur les interactions cytosoliques ou protéine spécifique familles^{6,7, 8}. En revanche, travail limité a été fait pour étudier les interactions de protéine extracellulaire à l’aide de cette technologie. Nous avons développé une méthode de microarray de protéine pour permettre des études d’ePPIs en construisant une bibliothèque complète et diversifiée de protéines sécrétées purifiées et unique transmembranaire (STM) récepteurs exprimés comme recombinants domaines extracellulaires (DPE), fusionnées à balises communes pour affinité purification⁴. Le succès des écrans microarray protéine dépend fortement de la mise en place d’une bibliothèque de protéine de haute qualité. Pour l’expression de la protéine de la bibliothèque et la requête, les cellules de mammifères ou des cellules d’insecte préférentiellement apparaissaient comme des systèmes d’expression hétérologue, afin d’assurer le bon ajout de modifications post-traductionnelles telles que liaisons disulfure de glycosylation. SDS-PAGE, chromatographie d’exclusion et de diffusion de la lumière laser multi-angle sont des techniques couramment utilisées pour évaluer la qualité des protéines recombinantes. La bibliothèque de la protéine est ensuite repérée sur des diapositives epoxysilane et conservée à-20 ° C pour une utilisation à long terme. Les concentrations de protéine au-dessus de 0,4 mg/mL sont recommandées pour le protocole décrit ci-dessous. Par conséquent, faible exprimant des protéines peuvent exiger une étape de concentration avant l’impression de l’échantillon et le stockage. Néanmoins, un principal avantage de cette technique est le faible volume de protéine nécessaire (50 μg de protéines est suffisante pour exécuter > 2 000 écrans), aux côtés de la consommation de protéines de requête minimale (20 à 25 μg par écran de doublons). Utilisant le protocole et les équipements décrits ici, et autant de bibliothèques sont disponibles, des résultats pour les protéines de requêtes individuelles peuvent être générés un jour ouvrable.

Un défi majeur dans la détection des interactions de protéine dans l’environnement extracellulaire découle de leur caractère typiquement faible ou transitoire, qui s’oppose à une identification par des méthodologies plus couramment utilisés. Accroître l’avidité de liaison grandement améliore la sensibilité pour la détection des protéines faibles interactions^9,10,11. Basé sur ce principe que nous avons développé une méthode pour multimerize les protéines de la requête (exprimées en fusion Fc) à l’aide de protéine A-enduit perles^4,5. Pour éviter toute éventuelle inactivation de la protéine de la requête par marquage aléatoire, nous plutôt étiqueter une immunoglobuline humaine hors de propos G avec Cy5 et ajoutez-le ainsi que de la protéine de requête pour les billes de protéine A, éliminant ainsi tous les artefacts en raison de la conjugaison directe d’un teindre à la protéine d’intérêt. Étant donné les affinités micromolaires de plusieurs paires de corécepteur, les complexes multivalents augmentent considérablement le rapport signal sur bruit, par rapport aux protéines de requête Fc-fusion projetés en protéines solubles⁴.

En résumé, le but du présent protocole est de décrire la préparation de lames microarray contenant une bibliothèque de protéines extracellulaires préexistant pour l’identification des interactions de récepteur-ligand. Nous passons en revue les étapes de la diapositive, impression, suivi d’un protocole de dépistage d’une protéine d’intérêt à la bibliothèque de protéines extracellulaires. De plus, on décrit une méthode pour la détection améliorée d’ePPIs issu des microbilles pour atteindre une avidité accrue de la protéine étudiée. La technologie de microarray de protéine extracellulaire décrite ici représente une approche rapide, robuste et efficace pour le dépistage et détection ePPI roman avec faible de faux positifs et en utilisant seulement microgramme par quantités de la protéine de la requête en vertu de enquête. Cette technologie a alimenté de nombreuses études qui ont fourni des renseignements pertinents sur jusque-là inconnues des fonctions cellulaires et voies de signalisation pour une variété de récepteurs^12,13, dont¹⁴d’immunoregulators virale, et peut être utilisé pour désactiver orphanize toute protéine extracellulaire d’intérêt.