البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للشاشة البروتين خارج الخلية [ميكروارس] للتعرف على التفاعلات رواية مستقبلات-يجند في إنتاجية عالية. كما يصف لنا طريقة لتحسين الكشف عن تفاعلات البروتين البروتين عابر باستخدام مجمعات البروتين-ميكروبيد.
Abstract
يفرز عوامل ومستقبلات غشاء المربوطة وشركائها المتفاعلة الهيئات التنظيمية الرئيسية للاتصالات الخلوية والشروع في إشارات الشلالات خلال التوازن والمرض، وعلى هذا النحو تمثل الأهداف العلاجية الرئيسية. وعلى الرغم من أهميتها، تظل هذه الشبكات التفاعل الممثلة تمثيلاً ناقصاً إلى حد كبير في قواعد البيانات الحالية؛ ولذلك، يكون معظم البروتينات خارج الخلية لا شريك ملزمة موثقة. هذا التناقض يرجع أساسا إلى التحديات المرتبطة بدراسة البروتينات خارج الخلية، بما في ذلك التعبير عن البروتينات الوظيفية، وتقارب ضعف، وانخفاض، تفاعلات البروتين التي كثيرا ما تنشأ بين مستقبلات سطح الخلية. والغرض من هذا الأسلوب وصف طباعة مكتبة بروتينات خارج الخلية بتنسيق ميكرواري للفرز لتفاعلات البروتين البروتين. لتمكين الكشف عن التفاعلات الضعيفة، ويرد وصف أسلوب يقوم على مولتيميريزيشن البروتين الاستعلام قيد الدراسة. بالإضافة إلى هذا النهج القائم على ميكروبيد مولتيميريزيشن لزيادة مولتيفالينسي، ميكرواري البروتين يتيح الكشف عن قوي لتفاعلات البروتين البروتين عابر في إنتاجية عالية. ويوفر هذا الأسلوب عينة السريع وانخفاض استهلاك–نهجاً للتعرف على التفاعلات الجديدة تنطبق على أي البروتين خارج الخلية. ويرد وصف البروتين ميكرواري الطباعة والفرز بالبروتوكول. هذه التقنية ستكون مفيدة للمحققين التماس وسيلة قوية لاكتشاف تفاعلات البروتين في الفضاء خارج الخلية.
Introduction
ويصف الأسلوب الذي استعرض هنا طباعة مجموعة من البروتينات خارج الخلية في تنسيق ميكرواري، تليها طريقة لفحص هدفا لمصلحة ضد هذه المكتبة. لقد حددنا مولتيميريزيشن البروتين كخطوة حاسمة للكشف عن التفاعلات التي تتميز بالصلات ملزمة منخفضة. تعزيز الكشف عن هذه التفاعلات، يصف لنا بروتوكول استناداً إلى مولتيميريزيشن البروتين الاستعلام من اهتمام باستخدام ميكروبيدس.
يفرز والمنظمين الرئيسيين للاتصالات الخلوية والإشارات والتفاعل مع المكروية الخلية أعرب عن سطح البروتينات (يطلق عليها مجتمعة البروتينات خارج الخلية) جنبا إلى جنب مع شركائها في التفاعل. ولذلك، أنها ضرورية في تنظيم الكثير من العمليات الفسيولوجية والمرضية. تقريبا ربع المجين البشري (إيتش فايف، 000 البروتينات) ترميز للبروتينات خارج الخلية، التي، نظراً لأهميتها وإمكانية الوصول للأدوية تم تسليمها بشكل منهجي، وتمثل أهدافا رئيسية للمخدرات التنمية1. ونتيجة لذلك، تمثل البروتينات خارج الخلية أكثر من 70% الأهداف البروتين مع العمل الدوائية المعروفة للأدوية المعتمدة على السوق، والمعروفة باسم “البروتين دروجابل”. على الرغم من أهميتها ووفرة، شبكات التفاعل (أبي) البروتين البروتين خارج الخلية يظل ناقصاً اللافت للنظر في قواعد البيانات المتاحة. وهذا يعود إلى طبيعة البيوكيميائية المعقدة من البروتينات خارج الخلية، مما يحول دون توصيف استخدام التكنولوجيات المتاحة الأكثر2. أولاً، يصعب بروتينات الغشاء من جعل، هي عملية غالباً ما ينطوي على ظروف قاسية الغسيل والمنظفات؛ ثانيا، غالباً ما تفتقد البروتينات خارج الخلية التعديلات ذات الصلة بوستترانسلاشونال مثل جليكوسيليشن التي غائبة عندما ترد هذه البروتينات في عادة تستخدم أنظمة مغايرة. وأخيراً، التفاعلات بين المستقبلات، مثل مستقبلات المشارك في الخلايا المناعية، وأعرب عن غالباً ما تكون عابرة واتسمت بوشائج منخفضة جداً (كد في ميكرومتر ~ 1 إلى > 100 ميكرومتر النطاق). بالإجمال، طبيعة هذه البروتينات وملزمة تقديم الشركاء الأكثر على نطاق واسع تستخدم التكنولوجيات، مثل تقارب تنقية/قياس الطيف الكتلي (AP/MS) أو خميرة-اثنين-الهجين، غير مناسب للكشف عن التفاعلات في الفضاء خارج الخلية 2 , 3.
في محاولة للتغلب على هذه التحديات التقنية والتعجيل باكتشاف رواية تفاعلات البروتينات خارج الخلية، قمنا بتطوير تغطية عالية بروتين خارج الخلية ميكرواري4،5. [ميكروارس] توفر ميزة توليد الأسطح عالية الكثافة مع كميات صغيرة من العينة، وهي عموما قابلة لدراسات الإنتاجية العالية. وفرت الدراسات ميكرواري البروتين سابقا أفكاراً ذات الصلة في تفاعلات البروتين لعدة نموذج الكائنات، أن كانت تركز أساسا على التفاعلات سيتوسوليك أو البروتين محددة الأسر6،7، 8. وفي المقابل، قد أنجز عمل محدودة للتحقيق في تفاعلات البروتين خارج الخلية باستخدام هذه التكنولوجيا. قمنا بتطوير أسلوب ميكرواري بروتين لتمكين الدراسات عبيس ببناء مكتبة شاملة ومتنوعة جداً من البروتينات يفرزها المنقي والمستقبلات (STM) transmembrane واحد أعرب عن المجالات خارج الخلية المؤتلف (النماء) تنصهر فيها العلامات الشائعة ل تنقية تقارب4. نجاح على شاشات ميكرواري البروتين تعتمد اعتماداً كبيرا على إنشاء مكتبة البروتين ذات جودة عالية. للتعبير عن البروتين كل مكتبة والاستعلام، خلايا الثدييات أو خلايا الحشرات تفضيلي اختيرت كأنظمة تعبير مغايرة، لضمان الصحيح إضافة التعديلات بوستترانسلاشونال مثل سندات glycosylation أو الميثيل. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، حجم الاستبعاد اللوني وضوء الليزر زاوية المتعددة تناثر من التقنيات الشائعة المستخدمة لتقييم نوعية البروتين المؤتلف. مكتبة البروتين ثم رصدت على الشرائح ابوكسيسيلاني وتخزينها في-20 درجة مئوية للاستخدام على المدى الطويل. وأوصت تركيزات البروتين تزيد من 0.4 ملغ/مل للبروتوكول هو موضح أدناه. ولذلك، قد تتطلب البروتينات منخفضة-وإذ يعرب عن خطوة تركيز قبل نموذج الطباعة والتخزين. ومع ذلك، مزايا رئيسية لهذا الأسلوب هي حجم صغير البروتين المطلوب (50 ميكروغرام من البروتين كافية لأداء > شاشات 2,000)، جنبا إلى جنب مع استهلاك البروتين الاستعلام الحد الأدنى (20-25 ميكروغرام كل التكرارات الشاشة). استخدام البروتوكول والمعدات الموصوفة هنا، وشريطة توافر المكتبات، يمكن توليد نتائج لاستعلام فردي البروتينات خلال يوم عمل واحد.
تحديا كبيرا في الكشف عن تفاعلات البروتين في البيئة خارج الخلية تنشأ من طبيعتها ضعيفة أو عابر مميز، مما يحول دون تحديد المنهجيات الأكثر استخداماً. ويحسن حساسية للكشف عن البروتين ضعف التفاعلات9،،من1011زيادة اللذة ملزمة إلى حد كبير. استناداً إلى هذا المبدأ قمنا بتطوير أسلوب مولتيميريزي البروتينات الاستعلام (معبراً عنها كالانصهار Fc) استخدام البروتين المغلفة بالخرز4،5. لتجنب أي المنظمة المحتملة من البروتين الاستعلام بوصفها عشوائية، نحن تسمية مناعي البشري غير ذي صلة ز مع Cy5 بدلاً من ذلك وإضافته جنبا إلى جنب مع البروتين الاستعلام الخرز البروتين أ، وبالتالي القضاء على أي القطع الأثرية بسبب تصريف مباشر صبغ لبروتين الفائدة. ونظرا للصلات micromolar عدة مستقبلات المشارك أزواج، يعزز المجمعات متعددي إشارة إلى نسبة الضوضاء، مقارنة بالبروتينات الاستعلام Fc-الانصهار فرزهم كالبروتينات القابلة للذوبان4.
وخلاصة القول، والهدف من هذا البروتوكول وصف إعداد الشرائح ميكرواري يحتوي على مكتبة بروتين خارج الخلية موجودة من قبل للتعرف على التفاعلات مستقبلات-يجند. نقوم بمراجعة الخطوات اللازمة للشرائح الطباعة، متبوعاً ببروتوكول لفحص بروتين تهم ضد المكتبة البروتين خارج الخلية. وعلاوة على ذلك، يصف لنا طريقة للكشف المعززة من أبيس استناداً إلى ميكروبيدس لتحقيق اللذة زيادة من البروتين قيد الدراسة. التكنولوجيا ميكرواري البروتين خارج الخلية الموضحة هنا تمثل نهجاً سريعة وقوية وفعالة للفحص والكشف عن أبي رواية مع انخفاض نسب إيجابية كاذبة، وعن طريق استخدام كميات ميكروغرام فقط من البروتين الاستعلام تحت التحقيق. وقد غذت هذه التكنولوجيا الدراسات المتعددة التي قدمت أفكاراً ذات الصلة في الوظائف الخلوية غير معروف سابقا ومسارات الإشارات لمجموعة متنوعة من مستقبلات12،13، بما في ذلك14من إيمونوريجولاتورس الفيروسية، ويمكن أن يستفاد من دي أورفانيزي أي البروتين خارج الخلية للفائدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يظل عدد كبير من مستقبلات اليتيمة في الجينوم البشري، ويواصل الشركاء المتفاعلة رواية الخروج للبروتينات خارج الخلية مع يغاندس تتسم سابقا. تحديد التفاعلات مستقبلات-يجند في الإنسان والكائنات نموذج أمر ضروري لفهم الآليات التي تملي الاتصالات الخلوية أثناء التوازن، فضلا عن التقلبات التي تؤدي ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر فيلامير كالسيس ويوين كوبي للغاية قراءة المخطوطة. ونحن ممتنون لراندي ين للمشورة التقنية الممتازة.
Materials
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473 (2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction–the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
