В естественных условиях Визуализация реактивнооксигенных видов мышиных раны модель
Summary
Мы описываем неинвазивные в vivo imaging протокол, рационального и экономически эффективным, используя L-012, хемилюминесцентный люминол аналоговый, визуализировать и количественно реактивнооксигенных видов (ров) сгенерирована модель мыши эксцизионная раны.
Abstract
Поколение реактивнооксигенных видов (ров) является отличительной чертой воспалительных процессов, но в избытке, оксидативный стресс широко вовлечено в различных патологий, таких как рак, атеросклерозом и диабетом. Ранее мы показали, что дисфункция ядерного фактора (эритроидные производные 2)-как 2 (Nrf2) / Кельха как эритроидные клетки производные протеин 1 (1Keap) сигнальный путь ведет к крайней ROS дисбаланс во время кожный заживление ран при сахарном диабете. Поскольку уровень рос являются важным показателем прогрессии заживления ран, конкретной и точной количественной оценки методов являются ценными. Были описаны несколько в vitro анализов для измерения рос в клетках и тканях; Однако они только обеспечивают единый накопительный измерения на сэмпл. Совсем недавно разработка показателей на основе белков и визуализации условия позволили уникальных пространственно-временных анализов. L-012 (C13H8ClN4НАО2) является производной люминол, может использоваться как в естественных условиях , так и в пробирке хемилюминесцентный обнаружения ROS, порожденных оксидазы NAPDH. L-012 излучает сильный сигнал, чем другие флуоресцентных зондов и было показано, быть конфиденциальной и надежной для обнаружения рос. Применимость промежуток времени L-012-способствовали изображений обеспечивает ценную информацию о воспалительных процессах, уменьшая потребность в жертву и общего сокращения числа исследования животных. Здесь мы описываем протокол, используя L-012-содействие в vivo imaging для количественного определения окислительный стресс в модели эксцизионная заживления ран с помощью диабетических мышей с локально неблагополучных Nrf2/Keap1.
Introduction
Метаболитов кислорода, порожденных через воспалительных процессов вклад различных сигнальных каскадов, а также деструктивные изменения клеточных компонентов1. Использование чувствительных и конкретные методы для измерения ROS имеет решающее значение для изучения воспалительных процессов и характеризующих последствия оксидативного стресса. В естественных условиях изображений является ценным из-за его способность обеспечивать динамические пространственные и временные данные в живых тканях. L-012 является синтетическим хемилюминесцентный зонд, который является весьма чувствительной для супероксид анионов и производит более высокие интенсивности света, чем другие флуоресцентных зондов в клетках, тканях и цельной крови1,2,3, 4. он успешно работал в vivo образов в мышиных моделях изучить несколько воспалительных заболеваний, в том числе артриты и колите5,6. Он еще использоваться в установленных кожный модель ранозаживляющее. Измерение Рось создан столь же важное значение для оценки прогрессирование заживление ран при различных условиях. Чувствительность и неинвазивный характер этого метода делает его перспективным технику для изучения заживления ран через мышиных моделях.
Nrf2 является основной движущей силой реакции антиоксидантной и transcriptional фактор со спецификой для элемента реагирования антиоксидант (являются), общие для регионов промоутер нескольких антиоксидантные ферменты8. В отсутствие оксидативного стресса Nrf2 поглощенных в цитоплазме, Keap1, который впоследствии вызывает его ubiquitination и деградации. Дисбаланс путь Nrf2/Keap1 был вовлечен в неуместным редокс гомеостаза и замедленного заживления ран в параметре Увеличение окислительного стресса9. Ранее мы показали, что подавление Keap1 стимулирует повышение активности Nrf2 и способствует спасения патологического кожный заживления ран в диабетической раны9.
Здесь мы описываем протокол, который использует L-012-помощь биолюминесценции imaging для измерения уровней рос в эксцизионная кожные раны исцеления модель, которая имеет решающее значение для подчеркнув связь между рос и заживление ран. Эта техника демонстрирует реального времени изменения окислительного бремени внутри раны и немедленного периферии. Кроме того этот метод позволяет для быстрой оценки мероприятий и механизмов, что влияет на окислительно-восстановительной обработки. Здесь мы используем модель Keap1 сногсшибательно для восстановления гомеостаза редокс оценить применимость нашей стратегии. Потому что наша техника является неинвазивным и раны спокойно, то же самое животное может использоваться для дальнейшего подтверждающего анализа на основе гистология или ячейки лизатов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Общие методы для измерения ROS была ограничена сложных протоколов, требующих извлечения тканей или аналогичным образом инвазивные методы. В последние годы на основе новаторских механизмов обработки изображений, тем самым позволяя пространственно-временных оценок9,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны доклинических Imaging Core в NYU школа медицины, особая благодарность Aristizabal Орландо и Юсеф Заим Wadghiri. Ядро — это общий ресурс, частично поддерживается Лаура и Исаак Перлмуттер рака центр поддержки гранта NIH/NCI 5P30CA016087 и NIBIB биомедицинских технологий ресурсов центр гранта NIH P41 EB017183. Эта работа была поддержана американская ассоциация диабета «Путь остановить диабет» округ [номер гранта 1-16-ACE-08] и NYU применяется исследовательский фонд поддержки для P.R.
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
