A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants

Stephen Nilsson-M&#248;ller; Michael Poulsen; Tabitha M. Innocent

doi:10.3791/58420

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Behavior

Una guía Visual para el estudio de las defensas contra comportamiento patógeno ataca en hormigas cortadoras

Published: October 12, 2018

doi:

10.3791/58420

Stephen Nilsson-Møller¹, Michael Poulsen¹, Tabitha M. Innocent¹

¹Centre for Social Evolution, Section for Ecology and Evolution, Department of Biology,University of Copenhagen

Summary

Presentamos a una guía visual a las conductas de defensa de la enfermedad en hormigas cortadoras, con clips individuales y definiciones que lo acompaña, en un escenario de infección experimental. Nuestro principal objetivo es ayudar a otros investigadores a reconocer comportamientos defensivos claves y proporcionar un entendimiento común para la investigación futura en este campo.

Abstract

El complejo estilo de vida, la historia evolutiva de cooperación avanzada y las defensas de la enfermedad de hormigas cortadoras están bien estudiadas. Aunque numerosos estudios han descrito los comportamientos relacionados con la defensa de la enfermedad y el uso asociado de antimicrobianos y productos químicos, no se ha hecho ninguna referencia visual común. El objetivo principal de este estudio fue grabar pequeños clips de comportamientos implicados en la defensa de la enfermedad, tanto como profilaxis como directamente dirigida a un antagonista de la Colonia después de la infección. Para ello se utilizó un experimento de infección, con las colonias de las especies de hormigas cortadoras Acromyrmex echinatiory la amenaza patógena conocida más importante cultivo fúngico de las hormigas (gongylophorus gongylophorus), especializado hongo patógeno del género Escovopsis. Había filmado y en comparación con las colonias infectadas y no infectadas, en las etapas tempranas y más avanzadas de la infección. Cuantificamos comportamientos defensivos claves a través de tratamientos y mostrar que la respuesta conductual al ataque del patógeno probable varía entre las diferentes castas de obreras y la detección temprana y tardía de una amenaza. Basado en estas grabaciones que hemos hecho una biblioteca de clips de comportamiento, acompañados por las definiciones de los principales comportamientos defensivos individuales. Esperamos que tal guía puede proporcionar un marco común de referencia para que otros investigadores que trabajan en este campo reconocer y estudiar estos comportamientos y también proporcionar un mayor alcance para comparar diferentes estudios para, en definitiva, ayudar a comprender mejor el papel Estos comportamientos se juegan en la defensa de la enfermedad.

Introduction

Hormigas cortadoras son avanzadas insectos sociales, formando algunas de las colonias más complejas en la tierra. Son una rama derivada de las hormigas de cultivo de hongos (tribu Attini) que consta de dos géneros Acromyrmex y Atta¹. Se cultiva la especie de cultivo hongo gongylophorus gongylophorus (Basidiomycota: Agaricales), que dependen de su fuente principal de alimento²^,³. Las hormigas suministrar este hongo con el material de hojas frescas para su crecimiento, y el hongo produce en alimento-rico hinchadas hyphal consejos (gongylidia) que son consumidos por las hormigas y su cría. Las colonias están construidas bajo tierra, se mantiene el cultivo de hongos en jardines externos⁴^,⁵, y los agricultores y protegen su monocultivo cultivo de patógenos potenciales⁶^,⁷^,⁸ ^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Las colonias división laboral entre trabajadores de diverso tamaño (casta) y edad¹³^,¹⁴^,¹⁵, que se extiende a la defensa de las hormigas y cultivos de agentes patógenos.

Podemos esperar que las colonias de hormigas cortadoras sean vulnerables a las enfermedades. Grupo vida pretende facilitar la propagación de enfermedades entre los trabajadores debido a las frecuentes interacciones y, por tanto, más fácil transmisión¹⁶. Las hormigas son susceptibles a parásitos hongos entomopatógenos, como especies de Metarhizium y Beauveria bassiana⁶. Estos parásitos son generalistas y a menudo están presentes en el suelo cerca de los nidos⁷^,⁸. La agricultura del cultivo de hongos como un monocultivo⁴^,⁵ es probable que también sea susceptible a enfermedad¹⁷^,¹⁸. Pueden ser infectado por parásitos hongos generalista (incluyendo especies de Aspergillus niger y Trichoderma ³); sin embargo, la amenaza más importante es un hongo de necrótrofos especialista en el género Escovopsis (Ascomycota: Hypocreales)¹¹. A través de la secreción de enzimas de mycolytic y otros compuestos, Escovopsis mata y obtiene nutrientes del hongo cultivo¹², con consecuencias potencialmente fatales para la hormiga colonias¹¹^,¹⁹.

Para combatir las amenazas de la enfermedad, las hormigas tienen defensas notable a nivel individual y Colonia, que combina control de biológico, defensas químicas y comportamiento para actuar como profilaxis y, cuando sea necesario, en respuesta a la infección. Colectivamente, estas defensas prevenir o reducen el impacto de las infecciones causadas por patógenos generalistas y especialistas como el Escovopsis. General implican evitar la contracción de los parásitos en el ambiente²⁰, prevenir parásitos de entrar en el nido y limitar la propagación de la infección dentro de nidos. Las primeras líneas de defensa incluyen productos químicos de secreciones glandulares³^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^, ²⁷ para desinfectar sustratos de plantas, a través de trabajadores lamiendo antes de la incorporación en el jardín del hongo y hormigas llevando a cabo tanto uno mismo – y acicalamiento. Cuando la preparación, especialmente al entrar en el nido, los trabajadores también pueden aplicarse las secreciones fecales ácidas a su cuerpo de²⁷. Estas defensas profilácticas son demostrable importantes para evitar la infección por patógenos amenazas⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^, ¹².

Si fallan las defensas iniciales y un patógeno como el Escovopsis consigue entrar en el nido y el jardín de hongos, y si la infección se detecta en una etapa temprana, las hormigas utilizan hongos arreglarse para eliminar esporas²⁵^,²⁸_. Las hormigas pueden aplicar las secreciones de las glándulas metapleural o transferir las esporas al bolsillo infrabuccal (una cavidad bucal), donde se mezclan con un cóctel químico que contiene de las secreciones de la glándula metapleural y labial²⁶. Hay más de 20 compuestos conocidos en estas glándulas, incluyendo γ – ceto – carboxílico- y indoleactic ácidos³. Estos son activamente aplicada²⁵, tienen propiedades antibióticas, fungistático y fungicida²⁹y pueden inhibir el Escovopsis espora germinación³⁰. Esporas en el bolsillo de infrabuccal más tarde son expulsadas fuera de la Colonia³¹^,³². La mayor parte de este hongo después de la detección inicial de la preparación se lleva a cabo por los trabajadores menores de²⁸^,³³. Sin embargo, si un patógeno logra evitar la detección y se extiende en el jardín de hongos, tanto los trabajadores mayores y menores eliminar partes infectadas de los hongos²⁸y este material eliminado es depositado fuera del nido³¹. Además, mantienen especies en el género de cortadoras Acromyrmex utilizan control biológico en forma de antibióticos producidos por simbióticas Actinobacteria³⁴^,³⁵^,³⁶— en la hormiga cutícula³⁷principales predominante jóvenes³⁴^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰— para producir compuestos que previenen el crecimiento micelial de Escovopsis ³⁴ ^, ³⁸ ^, ⁴¹. esta producción antibióticos a su vez puede ser deteriorada por Escovopsis-produce compuestos durante una infección¹⁹.

Figura 1: características morfológicas Ant. Un dibujo esquemático del hormiga mostrando las estructuras morfológicas mencionadas en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Defensas de hormigas cortadoras así constituyen un conjunto integrado de mecanismos conductuales y químicos que estas hormigas colectivamente proporciona protección muy eficaz contra la enfermedad⁴². Comprensión de estas defensas es de amplio interés, y han sido extensivamente investigados¹⁶^,²⁰^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴. Sin embargo, una recopilación visual de los comportamientos defensivos que inequívoca definición y descripción de ellos para el uso sistemático de los investigadores es, a nuestro conocimiento, no está disponible. Aunque la terminología utilizada para describir el comportamiento de la hormiga está relativamente estandarizada, por lo tanto no existe certeza que los mismos actos conductuales se nombran sistemáticamente en diferentes estudios. Aquí, nuestro principal objetivo es remediar esto proporcionando claridad y normalización a través de una compilación de grabaciones de vídeo de los comportamientos individuales de profilácticos y defensiva acompañada de definiciones asociadas. Grabamos estos videos durante un experimento conductual, en el que observar y cuantificar comportamientos en el contexto de infecciones experimentales Escovopsis sub colonias de Acromyrmex echinatior , cuyos resultados también presentamos aquí como un ejemplo ilustrativo de cómo esta compilación puede ser utilizada para estudios de comportamiento.

Protocol

1. aislamiento Escovopsis Aislar cepas Escovopsis de colonias de Acromyrmex echinatior laboratorio, colocando fragmentos jardín del hongo, con hormigas retiradas, sobre una placa de Petri con algodón húmedo por varios días hasta que Escovopsis germina y sporulates. Transferencia de esporas a placas de agar papa dextrosa (PDA, 39 g/L) e incubar a aprox. 23° C durante aproximadamente dos semanas.Nota: Se utilizó una cepa en el estudio actual. Utilice una aguja estéril para seleccionar esporas maduras de estas primeras placas. Recoger suficientes esporas para cubrir la punta de la aguja. Inocular las esporas en placas nuevas condiciones estériles e incubar a ~ 23 ° C durante aproximadamente dos semanas. Cuando hifas han cubierto toda la placa y convertido en esporas marrón maduritas, repita paso 1.3 pero esta vez con esporas de la nueva placa de PDA. Repita el proceso hasta que una acción limpia de Escovopsis para cada cepa adquirida (no contaminantes visibles en o debajo de la superficie de la placa de crecimiento). 2. Montaje experimental Utilizar tres colonias de a. echinatior .Nota: Aquí las colonias Ae160b, Ae322 y Ae263 fueron utilizadas. De cada colonia, hacen sub-colonias 12. Hacer seis sub-colonias para la observación después de 0 h y seis sub-colonias para la observación después de 72 h. Esto da un total de 36 colonias sub; marcar la mitad de las colonias sub de cada colonia ‘padre’ como control y la otra mitad como’Escovopsis tratamiento’.Nota: Mientras que en las colonias los padres la presencia de una reina afecta el comportamiento del trabajador, esperamos (aunque esto no se puede garantizar), que reina-menos las colonias suelen comportarse como colonias de queenright por el corto período de tiempo que se ejecuta el experimento. Para cada sub-Colonia, utilice una caja cuadrada de la longitud: ~ 3,15 pulgadas (8 cm), anchura: ~ 2,17 en (5,5 cm) y profundidad ~ 1,77 pulgadas (4,5 cm).Nota: El punto importante es prever suficiente espacio hormigas fuera el fragmento de hongo de forraje y basura de la descarga, pero al mismo tiempo para hacer la caja lo suficientemente pequeño que filmar y comportamiento reconocimiento es factible. Para cada colonia sub, agregue un trozo de cucharilla de tamaño (aproximadamente 2,2 cm3 y 1.2 g) de la parte central del jardín de hongos (L. gongylophorus) de la colonia original, un par de hojas de Zarza, y un pedazo de algodón empapado en agua.Nota: El algodón proporciona humedad. No debe estar goteando con agua y no debe tocar el jardín de hongos. Para las colonias tratadas con Escovopsis, utilizar un asa de inoculación y rellene la apertura por lo que sólo está cubierta por Escovopsis esporas. Inocular las esporas golpeando suavemente una parte pequeña, localizada del jardín de hongos diez a veinte veces para que las esporas no están agrupadas también. Para las sub-colonias utilizadas como controles, simular la aplicación de Escovopsis en el jardín de hongos con un asa de inoculación estéril.Nota: Aunque esto no fue hecha en el presente experimento, la inoculación de un polvo estéril (como polvo de talco o grafito) puede hacerse en esta etapa distinguir entre una infección con un patógeno y un agente inerte. De 72 h de observaciones, dejar la mitad de las colonias sub (controla e infectados) 72 h después de la introducción del Escovopsis antes de añadir las hormigas o iniciar la grabación de vídeo.Nota: Esperar 72 h en ausencia de hormigas es probable que Escovopsis esporas germinará (inéditos en vitro datos); Aunque esto también aumenta la posibilidad de otras infecciones (por ejemplo, de un hongo presente en el jardín de hongos), este período de tiempo es preferible que este tratamiento representar la fase inicial de una infección establecida. 0 h observaciones, directamente después de paso 2.6 y aproximadamente 30 minutos antes de grabar, añadir cría dos, cuatro trabajadores menores y cuatro mayores al mismo tiempo de la colonia de padres a cada caja. Uso dos trabajadores principales de en el jardín que son jóvenes con pigmento de luz, con Actinobacteria cubriendo la mayor parte de la cutícula. Tome las otras dos de fuera del jardín, con pigmento oscuro y Actinobacteria que sólo cubre las placas laterocervical. Para las observaciones de 72 h, repetir 2.8 y 2.8.1 en 30 min antes de grabar, es decir, 71,5 h después de la inoculación con Escovopsis.Nota: Las colonias sub Experimental son significativamente menores que las colonias de Acromyrmex naturales establecidas. Esto es necesario para registrar con precisión el comportamiento. Mientras que esto puede influir en la frecuencia de algunos comportamientos cualitativamente, la composición de las colonias fue elegida para reflejar la mezcla de los trabajadores en colonias naturales más probable reflejar cualitativamente las interacciones conductuales. 3. video grabación y anotar conductas Uso de un endoscopio USB conectado a un ordenador portátil (o equivalente) y proporcionar la luz suficiente. Para cada sub-Colonia, realizar grabación de vídeo de 4 h (a partir de las 0 h o infección después de 72 h). Después de grabar las 36 colonias sub, revisar el total de 144 horas de metraje y puntuación todos los comportamientos de interés para todos los individuos en cada colonia sub.Nota: En el ejemplo experimental actual, tenemos que excluir las sub-colonias dos (un control de Colonia Ae160b) y una sub-Colonia tratamiento de Colonia Ae322 debido a la infección con hongos distintos Escovopsis, reducir el número total de horas de observaciones a 136. Cada vez se observa un comportamiento, grabarlo como 1 ocurrencia.Nota: Un comportamiento puede sea de corta o larga duración, pero sólo cuenta como > 1 si es interrumpido por otro comportamiento, o si la hormiga es pasiva por un periodo de tiempo. 4. comportamientos Nota: Las definiciones conductuales fueron hechas usando una combinación de descripciones de anteriores estudios23,27,28,31,45 y observaciones personales. Para una ilustración detallada mostrando estructuras morfológicas importantes utilizadas en el protocolo para el reconocimiento de comportamientos, véase la figura 1. La preparación y limpieza de antena (Video 1) AVISO Si la hormiga detiene el movimiento de las piernas para iniciar la preparación. Compruebe que las antenas se tiran a través de los limpiadores de antena en las patas delanteras (figura 1), una estructura de abrazadera-como en la articulación de la tibia tarso consisten en una muesca frente a un estímulo con diferentes tamaño de cerdas y peines45, 46. Después de la limpieza de la antena, tenga en cuenta que la hormiga se limpie las piernas y los limpiadores de la antena, tirando de las piernas a través de las piezas bucales, eliminación de partículas y patógenos potenciales con la glossa (figura 1).Nota: La preparación puede consistir en limpieza de la antena y, posteriormente, los limpiadores de la antena (figura 1), pero también con partes bucales para limpiar las patas. Cuando una hormiga es limpiar sus patas, más a menudo limpia las seis patas en sucesión. Hongo de la preparación (vídeo 2) AVISO Si la hormiga detiene los movimientos de la pierna en un punto fijo en el jardín de hongos. Observar que las antenas son inmóviles y paralelas apuntando hacia el hongo para que el ángulo entre la escápula y Spermaticus (figura 1) es de aproximadamente 45 °, y la punta de las antenas casi se toquen entre sí, cerca de las puntas de las mandíbulas ( Figura 1). Tenga en cuenta que la parte superior (maxilar) y menor piezas bucales (labio) están abiertos, con el surgimiento de glossa (figura 1) a lamer el hongo. Acicalamiento (Video 3) Observar este comportamiento cuando una o más hormigas han acercado otra hormiga (destinatario) o viceversa. En el comportamiento, las hormigas detiene el movimiento y unirnos estrechamente con contacto físico. El ant(s) aseo puede moverse ligeramente para cubrir un área mayor del cuerpo de la hormiga destinatario. Observar que las antenas del actor pueden ser inmóvil y acentuado hacia un punto específico del receptor ant o mover y golpeando ligeramente el receptor. El ángulo entre la escápula y el Spermaticus (figura 1) es de aproximadamente 45 ° dependiendo de si se fija en un punto específico o tapping. Las puntas de las antenas del actor son generalmente cerca de ellos y con las puntas de las mandíbulas (figura 1). Tenga en cuenta que la parte superior (maxilar) y menor piezas bucales (labio) están abiertos, con el surgimiento de glossa (figura 1) a lamer la hormiga del receptor. Preparación de la glándula Metapleural (Video 4) Observar cuando la hormiga detiene movimiento para iniciar la preparación de (figura 1) de la glándula metapleural. Tenga en cuenta que la hormiga se inclina hacia un lado para llegar a uno de su parte posterior de las patas delanteras a frotar la abertura (meato) de la glándula metapleural (por ejemplo, la pata delantera derecha).Nota: La otra pata delantera es al mismo tiempo (en este caso la pata delantera izquierda) lamida por glossa (figura 1). Compruebe que la hormiga se inclina hacia el lado opuesto y cambia las piernas y repite el mismo movimiento con las piernas opuestas. La hormiga sigue moviendo las patas delanteras las glándulas metapleural y posteriormente la glossa cambiando constantemente entre las piernas (figura 1).Nota: En este ejemplo, la hormiga ahora pasará la pata delantera izquierda a la glándula metapleural y la pata delantera derecha para glossa (figura 1). Después de la glándula metapleural (figura 1) de la preparación, la hormiga a menudo inicia la preparación (paso 4.1). Espora escarda (Video 5) Observar este comportamiento cuando la hormiga detiene los movimientos de la pierna en un punto fijo en el jardín de hongos. Observar que las antenas son inmóviles y paralelo, apuntando hacia el hongo para que el ángulo entre la escápula y Spermaticus es aproximadamente de 45°, y las puntas de las antenas casi toquen entre sí y las puntas de las mandíbulas (figura 1). Compruebe que la hormiga abre sus mandíbulas (figura 1) esporas Escovopsis visibles y separar del cultivo hongos tirando de ellos. La hormiga lleva el racimo de esporas fuera del nido, mientras que las antenas están moviendo suavemente para orientación. Las antenas pueden ser limpiadas a través de los limpiadores de la antena (figura 1; ver 1 Video) mientras sostiene el conjunto de esporas. La hormiga deja las esporas en una pila de residuos.Nota: Registro de la actividad alrededor de la pila de residuos no se ha hecho en el experimento actual pero sería una extensión adecuada del protocolo actual. Hongo escarda (Video 6) Observar este comportamiento cuando la hormiga detiene los movimientos de la pierna en un punto fijo del hongo. Las antenas apunten ligeramente hacia la parte del hongo que la hormiga es tratar de sacarla, mientras aprovechando un poco el pedazo de hongo. Observar que la hormiga utiliza sus mandíbulas de corte mediante el cultivo de hongos para separar un área específica, o a una parte del pedazo de hongo con sus mandíbulas (figura 1). La hormiga se simultáneamente de la roca de lado a lado sobre sus piernas, mientras tira el pedazo de hongo.Nota: Deshierbe puede hacerse por varios trabajadores y por tanto menores como mayores. Si, algunas hormigas y el corte de hongo, otros realizan el balanceo y movimiento de tracción. La parte independiente del hongo es llevada fuera del nido y dejar en la pila de residuos. Grabación del depósito de residuos no se ha hecho en el experimento actual pero sería una extensión adecuada del protocolo actual. Líquido fecal grooming (Video 7) Observar este comportamiento cuando la hormiga detiene los movimientos de la pierna en un punto fijo en el jardín de hongos. La hormiga dobla su gaster (figura 1) y cabeza de uno hacia el otro para aplicar una gotita de líquido fecal a las piezas bucales. Observar que la hormiga tira las patas delanteras a través de las mandíbulas (figura 1), uno a la vez. Posteriormente, la hormiga mueve las antenas a través de los limpiadores de la antena (figura 1) ubicados en la articulación de la tibia tarso de las patas delanteras. Regurgitación de la gotita (Video 8) Observar este comportamiento cuando la hormiga detiene los movimientos de la pierna en un punto fijo del hongo. Las antenas son inmóviles y paralelo, apuntando hacia el hongo para que el ángulo entre la escápula y Spermaticus es aproximadamente de 45°, y las puntas de las antenas casi tocan uno al otro y las puntas de las mandíbulas (figura 1). Observar que la hormiga regurgita una gota de líquido sobre el hongo, variando de ser transparente a la luz amarilla o incluso marrón, de sus piezas bucales.

Representative Results

El objetivo principal de este estudio fue la creación de pequeños clips que ilustran comportamientos asociados con la defensa de la enfermedad en hormigas cortadoras, para generar un catálogo para ser utilizado como referencia para futuros estudios. Además, el estudio utiliza un ejemplo de un montaje experimental en el que estos comportamientos se cuantificaron para mostrar cómo se puede utilizar este catálogo en estudios de comportamiento, que los resultados representativos de las cuales resumimos aquí. Sub-Colonies se crearon para la observación en etapa temprana (0 h) y última infección de etapa (72 h). Debido a las infecciones pesadas con hongos distintos Escovopsis después de 72 h, dos colonias sub (un control Colonia Ae160b) y un tratamiento para la Colonia Ae322 se excluyeron, por lo que la presentación de los resultados se centran en el momento 0 h y poner menos énfasis en comportamientos observados después de 72 h. Después de filmar todas las colonias y anotando las conductas defensivas, se encontraron diferencias en los patrones de comportamiento asociados con el tiempo después de la infección y el contexto, incluyendo las diferentes maneras en que fueron utilizados por los trabajadores mayores y menores. En cambio, la preparación fue realizada en todas las veces en control y sub-colonias infectadas. También era común cuando las hormigas fueron buscando y tratar de sacarla, Escovopsis hifas o esporas. Porque este comportamiento era tan universalmente observado y frecuentes en todas las situaciones, no cuantificarlo. Marcamos todos los comportamientos descritos en el protocolo y presente frecuencias totales y promedio calculadas para los trabajadores mayores y menores por las colonias (tabla 1). Se encontró que en los controles, menores trabajadores arreglen el jardín cosecha más de trabajadores principales(Figura 2a) y observaron de manera anecdótica que pasaron más tiempo en el jardín de hongos. En las colonias infectadas con Escovopsis había una tendencia para el hongo mayor aseo en general en relación con las colonias de control, pero esto no fue significativo (F1,23 = 2.80, p = 0.1077; Tabla 2; Figura 2 un). hubo un aumento no significativo en grooming fecal con la infección (F1,23 = 0,60, p = 0.4455; Tabla 1) pero ninguna diferencia entre los trabajadores mayores y menores (figura 2b). Observamos fecales preparación cuando los trabajadores entraron en el hongo, en lugar de cuando estaban en o totalmente del hongo durante largos períodos de tiempo. Figura 2: frecuencia de aseo eventos. Significa número (± errores estándar (SE); n = 9) de (a) hongo grooming y (b) fecal líquido preparación eventos en cuatro horas después de la inoculación, que comparan los trabajadores mayores y menores controles y tratamientos Escovopsis . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Varios comportamientos eran extremadamente raros. Sólo observamos cuatro veces la preparación de la glándula metapleural, y todas las instancias se produjeron después de 72 h; vez en el grupo control y tres veces en colonias con Escovopsis infección (tabla 1). Casi como pocas veces, nos encontramos con que las hormigas regurgitan una gota de líquido en el jardín de hongos y un par de veces fuera del hongo (tabla 1). En los grupos de 0 h, esto sucedió una vez en una colonia de control secundario y dos veces en colonias infectadas – en los tres casos el comportamiento fue realizado por un trabajador mayor. En una ocasión un trabajador menor de edad había regurgitado una gota en la esquina de la caja y una vez que un trabajador mayor hizo lo mismo en una hoja de Zarza, ambos en el tratamiento del Escovopsis . En las colonias de 72 h, regurgitación de la gota sobre el hongo nunca fue observada en las colonias de control pero pasó siete veces en las colonias infectadas. Seis de ellas eran grandes trabajadores y tres de ellos por una sola persona que añade gotas fuera del jardín de hongos. Espora escarda (figura 3a) y desmalezado de hongo (figura 3b) eran ambos bajo en frecuencia. Mientras que no hubo ninguna diferencia significativa en la frecuencia de hongos escarda entre colonias infectadas y controles, hubo una tendencia para el desmalezado para aumentar con el tiempo desde la infección (F1,23= 2.91, p = 0.1014; Tabla 2). nuestras observaciones en espora Escovopsis escarda, que no cambió significativamente con el tiempo, pero hubo una tendencia a una mayor frecuencia en las colonias infectadas con Escovopsis que en los controles no infectados (F1,23 = 3.27, P = 0.0838; Tabla 2). las colonias sub menos infectadas por Escovopsis tenían esporas visibles restantes después del período de observación con una infección de la temprano-etapa (cuando las hormigas se introdujeron después de 0 h de la inoculación de esporas), con las hormigas eliminar casi todas las esporas en la mitad de las colonias sub (4 de 9; Figura 3 c). en infecciones de etapa posteriores (donde las hormigas se introdujeron después de 72 h de la inoculación de esporas), las hormigas no fueron capaces de eliminar esporas totalmente en cualquiera de las colonias sub. Tomados en conjunto, estas observaciones sugieren una tendencia a que las hormigas a cambio de espora escarda escarda en el transcurso de una infección de hongo. Figura 3: frecuencia de eventos de boda. Media frecuencia (± errores estándar (SE); n = 9) de (a) boda de esporas (de Escovopsis esporas) y (b) hongos escarda (Escovopsis u otros hongos) durante un período de observación de 4 h, comparando los menores y mayores de los grupos de tratamiento, y (c) el número de las colonias con visible Escovopsis esporas en grupos de tratamiento al final del período de observación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Menores trabajadores – control Menores trabajadores – tratamiento Trabajadores mayores – control Trabajadores mayores – tratamiento 0h Preparación de hongos 84 (9.333) 131 (14.56) 37 (4.111) 66 (7.333) Acicalamiento 6 (0.6667) 14 (1.556) 5 (0.5556) 6 (0.6667) Espora escarda 0 3 0 5 (0.5556) Boda de hongos 0 0 0 0 Preparación de fluidos fecales 46 (5.111) 69 (7.667) 27 (3.000) 48 (5.333) Aplicación de gotas 0 0 1 (0.1111) 2 (0.2220) Preparación de la glándula Metapleural 0 0 0 0 72h Preparación de hongos 10 (1.429) 45 (5.000) 24 (3.429) 38 (4.222) Acicalamiento 2 (0.2857) 10 (1.111) 1 (0.1110) 4 (0.4440) Espora escarda 0 0 0 1 (0.1110) Boda de hongos 0 1 (0.1110) 0 2 (0.2220) Preparación de fluidos fecales 19 (2.714) 38 (4.222) 30 (4.286) 30 (3.333) Aplicación de gotas 0 1 (0.1110) 0 6 (0.6667) Preparación de la glándula Metapleural 0 2 (0.2220) 1 (0.1429) 1 (0.1110) Tabla 1 : El número de comportamientos en cuatro horas de observación en 0 y 72 h después de Escovopsis inoculación. El número medio total de observaciones (con frecuencias de media por persona en los soportes), comparando trabajadores mayores y menores de control y Escovopsis colonias secundarias de infección, respectivamente (n = 9). Tipo 3 pruebas de efectos fijos Preparación de hongos Acicalamiento Fecal de la preparación Espora escarda Boda de hongos Efectos Num de DF Den DF Valor de F PR > F Num de DF Den DF Valor de F PR > F Num de DF Den DF Valor de F PR > F Num de DF Den DF Valor de F PR > F Num de DF Den DF Valor de F PR > F Colonia 2 23 0.77 0.4733 2 23 0,52 0.5989 2 23 0.54 0.5903 2 23 0.51 0.6052 2 23 1.17 0.3272 Sub-Colonia (Colonia) 6 23 0,93 0.4892 6 23 0.51 0.7978 6 23 0,63 0.7067 6 23 1.67 0.1742 6 23 1.53 0.2127 Tratamiento 1 23 2.8 0.1077 1 23 1.85 0.1875 1 23 0.6 0.4455 1 23 3.27 0.0838 1 23 1 0.3275 hora 1 23 6.53 0.0177 1 23 0.88 0.3574 1 23 0.97 0.3361 1 23 0.53 0.4742 1 23 2.91 0.1014 Tabla 2 : Las pruebas de resultados estadísticos de ANOVA mixto en comportamientos separados que pueden realizarse análisis estadísticos. Efectos fijos fueron Colonia, Colonia sub (anidado dentro de Colonia), tratamiento y tiempo. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Video 1: la preparación y limpieza de la antena. Por favor haga clic aquí para ver este video. Clic para descargar. Video 2: hongos aseo. Por favor haga clic aquí para ver este video. Clic para descargar. Video 3: acicalamiento. Por favor haga clic aquí para ver este video. Clic para descargar. Video 4: preparación de glándula Metapleural. Por favor haga clic aquí para ver este video. Clic para descargar. Video 5: espora boda. Por favor haga clic aquí para ver este video. Clic para descargar. Video 6: hongo boda. Por favor haga clic aquí para ver este video. Clic para descargar. Video 7: preparación de líquido Fecal. Por favor haga clic aquí para ver este video. Clic para descargar. Video 8: regurgitación gotita. Por favor haga clic aquí para ver este video. Clic para descargar.

Discussion

El objetivo primario de este estudio fue observar y registrar característica cortadoras ant defensiva comportamientos en presencia de infección de hongo-jardín con Escovopsis, creación de clips de referencia para utilizan por la comunidad científica. Cabe señalar que estos comportamientos no son excluyentes a la defensa de las colonias de Escovopsis, pero también puede desempeñar un papel en la defensa contra otros contaminantes e infecciones⁶^,⁷^,⁸^,⁹ ^,¹⁰^,¹¹^,¹²y en la defensa de las hormigas se⁴². Nuestro protocolo proporciona un telón de fondo para la investigación más amplia sobre las defensas en el cultivo de hongo hormigas. Esto es probable ser útil: (i) para los jóvenes investigadores que no están familiarizados con estos comportamientos; (ii) definiciones consistentes y observaciones de conductas; (iii) para facilitar las comparaciones entre estudios y especies de hormigas; (iv) porque varios de estos comportamientos pueden producirse tan infrecuentemente que incluso investigadores no pueden nunca han observado (iv) porque entender y reconocer comportamientos en condiciones controladas en la ayuda del laboratorio de estudios en situ donde las condiciones son más difíciles de controlar.

Los resultados de nuestro estudio comportamiento concuerdan con trabajos anteriores que mostraron que menores trabajadores hongo novio — crucial si una infección se detecta temprano, los trabajadores más mayores²⁵^,²⁸^,³². Aquí, los trabajadores principales aumentaron la cantidad de hongos de la preparación después de la infección Escovopsis (figura 2a). Esto sugiere que los menores trabajadores son los limpiadores de hongo predominante, pero que los trabajadores mayores pueden ayudar a prevenir la propagación de más establecido infecciones. Los trabajadores principales más grandes pueden eliminar las esporas más rápido, mientras que los trabajadores de menores podrían ser más adecuados para eliminar esporas menos accesibles. También se encontró que los trabajadores habían quitado con éxito esporas en alrededor de la mitad de las colonias de los infectados (cuatro de los nueve) cuando fueron introducidos en el momento de la infección y así se pudo detectar el patógeno temprano (figura 3c). En general, este señala a una serie de respuestas conductuales que las hormigas intentan primero detener Escovopsis infección mediante la eliminación de esporas y haciendo así antes una infección se propaga, en lugar de quitar las partes del jardín del hongo (figura 3a, b. ). Esto cambia con el tiempo si la infección progresa, cuando las hormigas son más propensos a sacar piezas del jardín de hongos²⁸. Aunque los tamaños de muestra fueron demasiado pequeños para ser concluyente, y no podemos descartar que infecciones simultáneas induce comportamientos weeding, nuestros datos apoyan esta tendencia, con hongo deshierbe predominante está presente en etapas posteriores de la infección (figura 3 una). Los niveles generalmente bajos de desmalezado de hongo podrían sugerir que las hormigas utilizan otras defensas (por ejemplo, químicos) para inhibir el crecimiento de Escovopsis, o que ninguna de nuestras colonias sub experimentales demasiado severamente estaban infectada (por lo que las más destructivas defensas innecesarias).

Nuestros resultados sugieren que la preparación con líquido fecal es característica de las hormigas en el jardín de hongos y utilizado como una medida profiláctica, en lugar de estar asociado con una infección. Observaciones similares se han visto en las hembras de la fundadora que asearse y transferencia gotitas fecales con la boca a sus piernas, al entrar en el nido o el manejo del cultivo²⁷. Una infección debería en teoría aumentar la actividad de los trabajadores en el borde del jardín del hongo, si el material infectado eliminado se realiza y se redujo en pilas de residuos. Por lo tanto, la preparación líquido fecal puede aumentar también indirectamente durante la infección para minimizar la diseminación de la enfermedad. Esperamos que el patrón opuesto para infecciones severas, con disminución del movimiento en el borde del jardín del hongo, como los trabajadores abandonan el hongo o adoptan medidas más extremas como defensa química.

Aunque fluidos fecales podrían servir como un profiláctico importante de química para un individuo, acicalamiento es utilizado por compañeros de nido en otros trabajadores si se detectan partículas extrañas o microbios. Observamos la diferencia substancial entre la frecuencia (tabla 1) de preparación de líquido fecal (n = 304) y de acicalamiento (n = 48) podría indicar una diferencia en la detección de patógenos. Las hormigas no son capaces de detectar fácilmente patógenos en sí mismos con sus antenas; por otro lado, acicalamiento es hecho por compañeros de nido, que pueden inspeccionar todo el cuerpo de una hormiga y sólo elegir para si es necesario. Puesto que Escovopsis es un parásito del jardín de hongos en lugar de las hormigas, esto también podría explicar la baja cantidad de acicalamiento.

Raramente observamos glándula metapleural preparación y sólo en etapas posteriores de la infección. Especies de cultivo de hongo hormigas con abundante cubierta bacteriana de Pseudonocardia novio las glándulas metapleural menos especies con menos o no cubrir²⁵^,⁴⁷. Como a. echinatior tiene una abundancia del simbionte⁴⁷, esto puede explicar la glándula bajo frecuencia de la preparación. La secreción de la glándula metapleural también es cara producir³⁰y se puede almacenar en el bolsillo de infrabuccal por períodos más largos de tiempo, lo que significa que la necesidad de la preparación de la glándula metapleural puede ser infrecuente. Durante la preparación de la glándula metapleural, las hormigas al mismo tiempo cambiar las piernas y lamen la pierna que sólo había arreglado la glándula; las esporas se transfieren así al bolsillo infrabuccal, donde las secreciones de la glándula son críticas para inhibir el Escovopsis‘ potencial de germinación posterior²⁵. Los menores trabajadores son más abundantes en el nido y tienen grandes glándulas metapleural por unidad masa³⁰de cuerpo, lo que sugiere que son responsables de la mayoría de las secreciones de la glándula metapleural. Esto también podría explicar por qué, en nuestro estudio, la frecuencia más alta del hongo de la preparación fue entre los menores trabajadores.

Esperábamos observar comportamientos que activa el uso de antibióticos desde el simbionte bacteriano Pseudonocardia, comúnmente observada en la cutícula de los trabajadores de Acromyrmex y conocida por desempeñar un papel en la defensa contra el Escovopsis ³⁶ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰. la explicación más probable para la no observación de tal comportamiento, es que la aplicación de estos antibióticos puede ser incorporada en otras conductas, tales como la preparación seguida por hongo grooming o escarda, que puede hacer difícil de observar como un comportamiento distinto.

Observamos el comportamiento inusual de regurgitar gotitas líquidas en el jardín de hongos. La regurgitación de los alimentos de similar se ha descrito previamente en la hoja de corte hormigas²². En nuestro experimento, gotitas diferían en color de transparente a café oscuro, lo que sugiere que pueden ser una fuente de alimento para otras hormigas o agua. Sólo observamos dos ocasiones donde otras hormigas bebieron de las gotas, por lo que no podemos determinar si las gotitas de beneficiarán a otras hormigas o sirven para rehidratar los hongos cuando la humedad es baja. Mayor número de observaciones de este comportamiento fueron durante las infecciones Escovopsis , que podrían implicar un papel defensivo, como inmune cebado por regurgitación de péptidos antimicrobianos¹⁶^,⁴⁸. No podemos sacar conclusiones firmes sobre esto ya que este comportamiento era raro, pero sería una línea interesante a investigar más a fondo, por ejemplo, mediante la determinación de si las gotas tienen propiedades antimicrobianas.

Dado los estudios observacionales de los complejos comportamientos defensivos de hoja-las hormigas, incluyendo cualquier comparación con y sin hongo infección jardín, sería extremadamente difícil de hacer en el campo, los datos experimentales pueden proporcionar información valiosa en Estos comportamientos bajo condiciones más controladas. Mientras que las observaciones realizadas en condiciones de laboratorio pueden diferir de los comportamientos encontrados en condiciones naturales, herramientas como el catálogo de comportamientos defensivos claves necesitan para desarrollarse, para mejorar tanto experimentales y estudios de campo en el futuro. El enfoque experimental sin embargo, puede explicar parcialmente porqué algunos comportamientos eran extremadamente raras (por ejemplo, acicalamiento, preparación de la glándula metapleural) en nuestra demostración del uso de estas definiciones conductuales. Estudios futuros podrían considerar, por tanto, las limitaciones de este montaje experimental, para encontrar maneras de hacer observaciones más naturales. Factores adicionales podrían integrarse también en el protocolo actual, por ejemplo distinguiendo entre portadores de Actinobacteria () jóvenes y trabajadores de edad avanzada con una cubierta menos abundante, que pueden responder diferentemente a la amenaza de un Escovopsis infección. Hay ventajas y desventajas entre hacer observaciones más precisas (por ejemplo marcando individuos focales) o tener la mayor sub-Colonia tamaño (a mayor número de trabajadores) y la cantidad de tiempo o número de individuos o sub-colonias que puede ser filmado en un determinado punto en el tiempo. Sin embargo, mientras que el montaje podría extenderse para mayores estudios de comportamiento con un enfoque en la atención de un objetivo conductual, en este caso nos enfocamos en presentar con éxito un método para registrar y definir comportamientos defensivos específicos.

Hemos documentado comportamientos que contribuyen a la defensa de las hormigas cortadoras de hojas, y más significativamente, han sistemáticamente identificados, descritos y capturado comportamientos defensivos en la película. Nuestros resultados representativos refuerzan otras investigaciones en este campo que sugiere por qué es difícil para un patógeno infectar con éxito las colonias de hormigas de cultivo de hongo, cuando frente a un amplio conjunto de comportamientos defensivos y asociados el uso de antimicrobianos compuestos. El principal objetivo era proporcionar una nueva herramienta para el trabajo futuro en este campo, y esperamos que el catálogo de comportamiento resultará valioso para asegurar el consenso y aerodinámicas definiciones, observaciones e interpretaciones de comportamientos, para servir como un recurso importante para la investigación futura.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a línea Vej Ugelvig y Kirsten Sheehy discusiones útiles con respecto a los mecanismos de los limpiadores de la antena de la preparación y puesta a punto de filmar. Michael Poulsen es apoyado por una beca de investigador joven Villum Kann Rasmussen (VKR10101) y Tabitha Innocent por un europeo individuales Marie Curie fellowship (IEF concesión 627949). También nos gustaría agradecer el Smithsonian Tropical Research Institute para el uso de instalaciones y apoyo logístico en Panamá y la Autoridad Nacional del Ambiente permiso para recolectar y exportar las hormigas a Dinamarca.

Materials

Plastic boxes	N/A	N/A	Transparent. Length: 3.15 in (8 cm), width: 2.17 in (5.5 cm), depth: 1.77 in (4.5 cm)
Petri dishes	Sarstedt	82.1472	3.62×0.63 in (9.2×1.6 cm)
Inoculation loops	Labsolute	7696431	Disposable 1uL. Length: 7.67 in (19.5 cm)
Cameras	DBPower	NTC50HD_8.5mm	USB Endoscope Camera
Holders for the cameras	N/A	N/A	Old beaker clamp stand.
Laptop	HP	N/A	Generic laptop for saving recordings.
Program used on the laptop	Windows Movie maker	N/A
Forceps	Vermandel	50.054	Soft
Potato dextrose broth	Sigma-Aldrich	P6685-1KG	24 g/L

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Nilsson-Møller, S., Poulsen, M., Innocent, T. M. A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants. J. Vis. Exp. (140), e58420, doi:10.3791/58420 (2018).

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