A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants

Stephen Nilsson-M&#248;ller; Michael Poulsen; Tabitha M. Innocent

doi:10.3791/58420

JoVE Journal > Behavior

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Behavior

Наглядное руководство для изучения поведенческих защиты от возбудителя нападения в муравьями-листорезами

Published: October 12, 2018

doi:

10.3791/58420

Stephen Nilsson-Møller¹, Michael Poulsen¹, Tabitha M. Innocent¹

¹Centre for Social Evolution, Section for Ecology and Evolution, Department of Biology,University of Copenhagen

Summary

Мы представляем наглядное руководство к болезни обороны поведения в муравьями-листорезами, отдельных клипов и сопровождающие определений, показано в сценарии экспериментальной инфекции. Нашей главной целью является помочь другие исследователи признают ключевые оборонительного поведения и для обеспечения общего понимания для будущих исследований в этой области.

Abstract

Сложный образ жизни, эволюционной истории сотрудничества и обороны болезни муравьями-листорезами хорошо изучены. Несмотря на многочисленные исследования описал поведений, связанных с болезнью обороны и связанные использования химических веществ и противомикробных препаратов, никаких общих визуальных ссылок был достигнут. Основной целью данного исследования было записывать короткие клипы поведения участвующих в болезни обороны, как профилактически, так и непосредственно ориентированы на антагонист колонии после инфицирования. Для этого мы использовали эксперимент инфекции с суб колоний видов муравьёв-листорезами царицами echinatiorи наиболее значительных известных патогенных угрозу для муравьев грибковых культур (Белошампиньон gongylophorus), специализированный патогенных грибов рода Escovopsis. Мы снимали и сравнил инфицированных и неинфицированных колонии на ранних и более продвинутых стадиях инфекции. Мы количественно ключевые оборонительного поведения через лечение и показать, что поведенческие ответ на нападения патогена вероятно варьируется между различными кастами рабочие муравьи и раннего и позднего обнаружения угрозы. На основании этих записей, которые мы сделали библиотека поведенческих клипов, в сопровождении определений основных индивидуальных оборонительного поведения. Мы ожидаем, что такое руководство может обеспечить общие рамки для других исследователей, работающих в этой области, распознавать и изучать эти поведения и также предоставляют более широкие возможности для сравнения различных исследований в конечном итоге помочь лучше понять роль Эти поведения играют в обороне болезни.

Introduction

Муравьями-листорезами развиты социальные насекомые, образуя некоторые из самых сложных колоний на земле. Они являются производным филиал выращивания гриба муравьи (племя Attini) состоящий из двух родов царицами и Атта¹. Они культивируют грибковых культур видов Белошампиньон gongylophorus (Базидиомицеты: Агариковые (порядок)), который они полагаются на как источник²^,их основным продуктом питания³. Муравьи поставлять этот гриб свежие листья материалом для ее роста, и грибок в свою очередь производит опухшие гиф питательн-богатые люди советы (gongylidia), которые потребляются муравьи и их расплодом. Колониях строятся подземные, грибковых культур поддерживается в внешние сады⁴^,⁵, и муравей фермерам защитить их культур монокультуры от потенциальных патогенов⁶^,⁷^,⁸ ^,⁹^,¹⁰^,^,¹¹¹². Колонии разделения труда между работниками разных размеров (каста) и возраст¹³^,¹⁴^,¹⁵, который простирается к обороне муравьи и культур от патогенов.

Мы могли бы ожидать, что колонии муравьев-листорезами должны быть подвержены болезни. Ожидается, что группа жизни облегчить распространение заболеваний между связанных рабочих из-за частого взаимодействия и, таким образом, легче передач¹⁶. Муравьи подвержены Энтомопатогенные грибковые паразиты, например Metarhizium видов и Beauveria bassiana⁶. Эти паразиты являются универсалы и часто присутствуют в почве вблизи гнезда⁷^,⁸. Выращивание культур гриба как монокультуры⁴^,⁵ делает вероятным также быть восприимчивы к болезни¹⁷^,¹⁸. Это может быть заражен универсалом грибковые паразиты (включая Aspergillus niger и Trichoderma видов³); Однако, наиболее серьезную угрозу представляет собой специалист necrotrophic гриб из рода Escovopsis (Аскомицеты: Гипокрейные)¹¹. Через секрецию mycolytic ферментов и других соединений Escovopsis убивает и получает питательные вещества от грибка культур¹², с потенциально фатальные последствия для муравей колонии¹¹^,¹⁹.

Для борьбы с угрозами, муравьи имеют замечательные оборону на уровне как индивидуальных, так и колонии, объединение биологического контроля, поведенческих и химической обороны действовать профилактически и, когда это необходимо, в ответ на инфекцию. В совокупности эти возражения предотвращения или уменьшения воздействия инфекции от патогенов общего профиля и специалистов, таких как Escovopsis. Целом они связаны, избегая сужением паразитов в среду²⁰, предотвращая паразитов попадание гнездо, и ограничение распространения инфекции в пределах гнезда. Первые линии обороны включают химических веществ из железистой секреции³^,²¹^,^,²²²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^, ²⁷ вылечить растение субстратов, через работников, облизывая их до включения в сад гриба и муравьи, проведение как само – и allogrooming. Когда холить себя, особенно при въезде в гнездо, работники могут также применяться кислой фекальными выделениями до их тела²⁷. Эти профилактической защиты являются явно важно, чтобы избежать заражения патогенными угроз⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^, ¹².

Если не первоначальный оборону и патогенов, таких как Escovopsis преуспевает в гнездо и грибок Сад, и если инфекция обнаруживается на ранней стадии, муравьи используют гриб, груминг удалить споры²⁵^,²⁸_. Муравьи могут применять выделениями из метаплевральная желез или передавать споры в infrabuccal кармане (полости), где они смешиваются с химического коктейля, содержащие метаплевральная и губной железы секреции²⁶. Существует более 20 известных соединений в этих желез, в том числе γ – кето – карбоновые- и indoleactic кислоты³. Эти активно прикладной²⁵, иметь антибиотик, фунгистатические и фунгицидные свойства²⁹и может подавлять прорастание спор Escovopsis ³⁰. Споры, хранящиеся в кармане infrabuccal позднее высланы за пределами колонии³¹^,³². Большая часть этого гриба, груминг, выявления ранней стадии осуществляется несовершеннолетних работников²⁸^,³³. Однако если Патоген удается избежать обнаружения и распространяется в рамках сад грибок, как мелких и крупных рабочих сорняков зараженные грибком²⁸, и удалить материал хранится вне гнезда³¹. Кроме того виды в роде-листорезами царицами использовать биологического контроля в виде антибиотиков, производимые симбиотические актиномицеты³⁴^,^,³⁵³⁶— поддерживается на муравей кутикулы³⁷преимущественно молодых основных рабочих³⁴^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰— для производства соединений, которые мешают мицелиальных роста Escovopsis ³⁴ ^, ³⁸ ^, ⁴¹. этот антибиотик производство в свою очередь может быть снижена в результате Escovopsis-производства соединений во время инфекции¹⁹.

Рисунок 1: морфологические особенности муравей. Схема, чертеж муравей показаны морфологических структур, упоминаемых в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таким образом-листорезами муравей оборону составляют сборку интегрированных поведенческих и химических механизмов, которые коллективно обеспечить эти муравьи очень эффективную защиту от болезни⁴². Понимание этих защит имеет широкий интерес, и они были широко изучены¹⁶^,²⁰^,⁴²^,^,⁴³⁴⁴. Однако визуальные сборник оборонительного поведения, которые помогли бы недвусмысленное определение и описание их для систематического использования исследователями, наши знания, не имеется. Хотя терминология, используемая для описания поведения муравьев является относительно стандартным, поэтому нет никакой уверенности, что же поведенческие акты последовательно названы в различных исследованиях. Чтобы исправить это путем предоставления ясности и стандартизации через сборник видео записей индивидуальных профилактических и оборонительных поведения, сопровождается соответствующие определения вот наша главная цель. Мы снимали эти клипы во время поведенческих эксперимент, в котором мы и количественная оценка поведения в контексте экспериментальных Escovopsis инфекций царицами echinatior суб колоний, результаты которого мы также представляем как Наглядным примером как эта компиляция может использоваться для поведенческих исследований.

Protocol

1. Escovopsis изоляции Изолируйте Escovopsis штаммов царицами echinatior Лаборатория колоний, размещая гриб сад фрагментов, с муравьями, удалены, на чашку Петри с влажной ватой за несколько дней до тех пор, пока Escovopsis прорастает и sporulates. Передавать споры картофеля декстроза агар пластины (КПК, 39 г/Л) и Инкубируйте на ca. 23° C приблизительно две недели.Примечание: Один штамм был использован в текущем исследовании. Используйте стерильные иглы, чтобы выбрать из зрелых споры из этих первых плит. Выберите достаточно споры для покрытия кончик иглы. Прививок споры на новые пластины в стерильных условиях и Инкубируйте на ~ 23 ° C приблизительно две недели. Когда гифы охватывает всю тарелку и превратился в зрелый коричневый споры, повторите шаг 1.3, но на этот раз с споры с новой пластинки КПК. Повторите процесс, пока чистый запас Escovopsis для каждого штамма приобрел (не видимых загрязнений, растущих на или под поверхностью пластины). 2. экспериментальные установки Используйте три колонии A. echinatior .Примечание: Здесь колонии, Ae160b, Ae322 и Ae263 были использованы. От каждой колонии сделайте 12 суб колоний. Сделайте шесть суб колоний для наблюдения после 0 h и шесть суб колоний для наблюдения после 72 ч. Это дает в общей сложности 36 суб колоний; Марк половина подпункта колоний от каждой колонии «родителя» как элемент управления, а другая половина «Escovopsis лечения».Примечание: В то время как в колониях родителей, наличие королевы влияет на поведение работника, мы ожидаем (хотя это не может быть гарантировано), что подпункт колоний королева менее склонны вести себя как queenright колоний за короткий период времени, которое проходит эксперимент. Для каждого суб колонии, использовать квадрат длины: ~ 3,15 дюймов (8 см), ширина: ~ 2.17 дюйма (5,5 см) и глубина ~ 1,77 дюйма (4,5 см).Примечание: Важно предоставить достаточно места для муравьёв за пределами фрагмента грибок для корма и сбрасывать отходы, но в то же время, чтобы сделать поле достаточно мал, что съемки и поведение признание возможно. Для каждого суб колонии, добавить кусочек ложка размера (около 2,2 см3 и 1.2 g) центральной части сада гриб (L. gongylophorus) из оригинальных колонии, пару листьев Брамбл, и кусок ваты, замачивают в воде.Примечание: Вата обеспечивает влажности. Он не должен быть капала с водой и не должны прикасаться саду грибок. Для суб колоний, лечили Escovopsisиспользуйте цикл прививки и заполнить открытие так просто покрыта Escovopsis споры. Прививать споры нажав осторожно небольшой, локализованные частью сада гриб десять-двадцать раз так что споры не слишком кластеризованный. Для вложенных колоний, используемых как элементы управления имитировать применение Escovopsis гриб сад с помощью стерильных прививка цикла.Примечание: Хотя это не было сделано в настоящем эксперименте, прививка стерильного порошка (как графит или тальк) может быть сделано на данном этапе проводить различие между инфекции с возбудитель и инертными агента. 72 h наблюдений, оставьте половину суб колоний (контролирует и инфицированных) за 72 ч после введения Escovopsis перед добавлением муравьи или начать запись видео.Примечание: Ожидание 72 h в отсутствие муравьев делает вероятным, что Escovopsis споры будут прорастать (неопубликованные в vitro данных); Хотя это также увеличивает вероятность других инфекций (например, от грибка, уже присутствующие в саду грибок), этот период времени является предпочтительным для этого лечения представить установленными инфекции на ранней стадии. Для наблюдения 0 hнепосредственно после шаг 2.6 и около 30 минут перед началом записи, добавьте два выводка, четыре несовершеннолетних трудящихся и рабочих четырех основных одновременно из родительского колонии в каждой коробке. Используйте два основных рабочих из в саду, которые являются молодые с легкими пигмента, с актиномицеты, охватывающих большую часть кутикулы. Возьмите два других от за пределами сада, с темный пигмент и актиномицеты, только покрытие плиты laterocervical. 72 h наблюденийповторите 2.8 и 2.8.1 в 30 мин перед записью, т.е., 71,5 h после прививки с Escovopsis.Примечание: Экспериментальная суб колоний значительно меньше установленных природных царицами колоний. Это необходимо для того, чтобы точно регистрировать поведение. Хотя это может повлиять на частоту проведения некоторых поведений качественно, состав Подкомиссии колоний был выбран, чтобы отражать сочетание рабочих в естественной колонии более вероятно качественно отразить поведенческие взаимодействий. 3. видео-записи и забил поведения Использовать USB эндоскоп прилагается к ноутбуку (или эквивалент) и дают достаточно света. Для каждого суб колонии выполните запись видео для 4 h (начиная с 0 h или 72 ч после инфекции). После записи 36 суб колоний, обзор в общей сложности 144 h кадры и оценка все поведения, представляющих интерес для всех лиц в каждом суб колонии.Примечание: В текущей экспериментальной примере, нам пришлось исключить два подпункта колоний (элемент управления из колонии Ae160b) и лечения суб колонии от колонии Ae322 из-за инфекции с грибками, помимо Escovopsis, сократить общее количество часов наблюдений до 136. Каждый раз, когда наблюдается поведение, запишите его как 1 возникновение.Примечание: Поведение может быть краткосрочной или долгосрочной перспективе, но только оценка его как > 1 если оно прерывается другой поведение, или если муравей пассивной для определенного периода времени. 4. поведение Примечание: Поведенческие определений были сделаны с помощью комбинации описаний из предыдущих исследований23,27,28,,3145 и личных наблюдений. Подробные иллюстрации, демонстрации важных морфологических структур, используемых в протоколе для распознавания поведений см. Рисунок 1. Самостоятельного ухода и очистки антенна (Видео 1) Обратите внимание, если муравей останавливается движение ногой инициировать самостоятельного ухода. Убедитесь, что усики извлекаются через антенну очистители на передних ногах (рис. 1) зажим как структура, расположенный на стыке голени Тарсус, состоящий из насечку перед шпоры с различными размера щетина и гребни в45, 46. После очистки антенны, отмечают, что муравей будет очистить ноги и антенна очистители, вытягивая ноги через ротовые, удаление частиц и потенциальных патогенов с Глосса (рис. 1).Примечание: Самостоятельного ухода может состоять из очистки антенна и впоследствии антенна для очистки (рис. 1), но и с помощью ротовые очистить ноги. Когда муравей является очистка его ноги, она чаще всего очищает все шесть ног подряд. Гриб, груминг (2 видео) Обратите внимание, если муравей останавливается движения ног в фиксированной точке на грибок в саду. Отмечают, что усики неподвижно и параллельных указал в сторону гриб, так, что угол между пейзаж и водянки (рис. 1) составляет примерно 45 °, и кончик усики почти соприкасаются друг с другом, недалеко от советы мандибулы ( Рисунок 1). Обратите внимание, что верхняя (челюстей) и Нижняя (губы) ротовые органы открыты, с появлением новых Глосса (рис. 1) лизать гриб. Allogrooming (3 видео) Наблюдать за такое поведение, когда один или несколько муравьев подошел еще один муравей (получателя) или наоборот. В ходе поведение муравьи остановить движение и стоять тесно вместе с физический контакт. Стрижка ant(s) может слегка пошевелить покрыть большую площадь тела муравья-получателя. Обратите внимание, что антенн кто может быть неподвижно и заостренные к определенной точке приема ant или перемещение и слегка нажав приемника. Угол между scape и водянки (рис. 1) составляет примерно 45 ° в зависимости от того, ли они фиксируются на определенной точкой или разговоров. Советы актера антенны, как правило, рядом друг с другом и советы мандибулы (рис. 1). Обратите внимание, что верхняя (челюстей) и Нижняя (губы) ротовые органы открыты, с новых Глосса (рис. 1) лизать муравей приемника. Метаплевральная железы уход (видео 4) Наблюдать, когда муравей останавливается движение начать уход метаплевральная железы (рис. 1). Обратите внимание, что муравей опирается на одну сторону, чтобы достичь одной из его передние ноги обратно руб открытия (проход), метаплевральная железы (например, правую переднюю ногу).Примечание: Другие передняя нога является одновременно (в этом примере Левая передняя нога) лизали Глосса (рис. 1). Проверьте, что муравей опирается на противоположной стороне и переключает ноги и повторяет же движение с противоположной ноги. Муравей продолжает двигаться передние ноги метаплевральная желез и впоследствии Глосса, постоянно переключение между ног (рис. 1).Примечание: В этом примере, муравей будет теперь передать Левая передняя нога метаплевральная железы и правую переднюю ногу к Глосса (рис. 1). После метаплевральная железы (рис. 1) груминг муравей часто инициирует самостоятельного ухода (шаг 4.1). Споро прополки (5 видео) Наблюдать за такое поведение, когда муравей остановки движения ног в фиксированной точке в саду грибок на. Отмечают, что усики неподвижно и параллельные, указал в сторону гриб, так что примерно 45°, угол между пейзаж и водянки и советы усики почти соприкасаются друг с другом и советы мандибулы (рис. 1). Проверьте, что муравей открывает его мандибулы (рис. 1), чтобы захватить видимой Escovopsis спорами и отделить их от грибковых культур, потянув их. Муравей уносит кластер споры из гнезда, в то время как усики осторожно двигаться для ориентации. Усики может быть очищены через антенны для очистки (рис. 1; см. видео 1) удерживая кластер споры. Муравей падает споры в куче отходов.Примечание: Запись активности вокруг куче отходов не было сделано в ходе текущего эксперимента, но будет подходящим расширение нынешнего протокола. Гриб прополки (6 видео) Соблюдайте это поведение при ant остановке движения ног в фиксированной точке гриба. Усики слабо указал на части гриба, который муравей пытается удалить, при этом слегка нажав грибов кусок. Отмечают, что муравей использует его мандибулы либо сократить через грибковых культур для отсоединения заданной области, или захватить часть грибок с ее мандибулы (рис. 1). Муравей одновременно будет рок из стороны в сторону на своих ногах, в то время как он тянет покинуть кусок грибок.Примечание: Прополка может быть сделано путем нескольких работников и несовершеннолетних и Майоров. Если некоторые муравьи делать, грибок резки, другие проводят качания и потянув движения. Отдельные части гриба осуществляется вне гнезда и высадили в куче отходов. Запись отходов месторождения не было сделано в ходе текущего эксперимента, но было бы подходящим расширение нынешнего протокола. Фекальный жидкость, груминг (7 видео) Наблюдать за такое поведение, когда муравей остановки движения ног в фиксированной точке в саду грибок на. Муравей изгибов ее Гастер (рис. 1) и головы друг к другу применять капли жидкости фекальных ротовые. Отмечают, что муравей тянет передние ноги через мандибулы (рис. 1), один за один раз. Впоследствии муравей движется антенн через очистители антенна (рис. 1), расположен на стыке голени Тарсус передних ног. Капелька регургитация (8 видео) Соблюдайте это поведение при ant остановке движения ног в фиксированной точке гриба. Усики неподвижно и параллельные, указал в сторону гриб, так что примерно 45°, угол между пейзаж и водянки и советы усики почти касаются друг друга и советы мандибулы (рис. 1). Отмечают, что муравей извергает капли жидкости на грибок, колеблется от Прозрачный светло-желтый или даже коричневый, от его ротовые органы.

Representative Results

Основной целью данного исследования было создание коротких клипов, которые иллюстрируют поведения, связанные с болезнью обороны в муравьями-листорезами, чтобы создать каталог для использования в качестве ссылки для будущих исследований. Кроме того исследование использует пример экспериментальной установки, в течение которого эти поведения были количественно показать, как этот каталог может использоваться в поведенческих исследований, представитель результаты которого мы суммируем здесь. Sub-Colonies были созданы для наблюдения на ранней стадии (0 h) и поздней стадии (72 h) инфекции. Из-за тяжелых инфекциях с грибками помимо Escovopsis после 72 ч были исключены два подпункта колоний (один элемент управления для колонии Ae160b) и один лечения для колонии Ae322, поэтому мы ориентируемся представление результатов на момент времени 0 h и положить меньше внимания на поведение наблюдается после 72 ч. После съемки все вложенные колоний и забил оборонительного поведения, мы нашли различий в модели поведения, связанные с временем после инфекции и контекст, включая различные способы, в которых они были использованы в мелких и крупных рабочих. В отличие от самостоятельного ухода была исполнена на все времена как управления, так и зараженных вложенных колоний. Было также принято когда муравьи были ищет и пытается удалить, Escovopsis гифы или споры. Потому что это поведение было настолько повсеместно наблюдаемые и частые во всех ситуациях, мы сделали не количественно. Мы забили все поведения, описанных в протокол и настоящего Вычисляемый общий и средний частот для мелких и крупных рабочих в суб колонии (Таблица 1). Мы обнаружили, что в элементах управления, несовершеннолетних работников ухоженный сад урожая более крупные рабочие (рисa) и занимательно отметил, что они тратят больше времени в саду грибок. В колониях, инфицированных с Escovopsis существует тенденция для увеличения гриб ухода в целом относительно управления колонии, но это не было значительным (F1,23 = 2.80, p = 0.1077; Таблица 2; Рисунок 2 ). существует значительное в фекальных груминг с заражения (F1,23 = 0,60, p = 0.4455; Таблица 1) но никакой разницы между мелких и крупных рабочих (рис. 2b). Мы наблюдали фекальных уход когда работников вошли гриба, а не когда они были на или полностью от гриба для длительных периодов времени. Рисунок 2: частота ухода события. Означают номер (± стандартные ошибки (SE); n = 9) () гриб груминг и (b) фекальных жидкости груминг события в течение четырех часов после прививки, сравнивая мелкие и крупные работников управления и Escovopsis лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Несколько поведений были крайне редки. Мы только наблюдали метаплевральная железы, груминг четыре раза, и все случаи произошли после 72 ч; Однажды в контрольной группе и три раза в колониях с Escovopsis инфекцией (Таблица 1). Почти как редко мы обнаружили, что муравьи бы извергнуть жидкие капли на грибок сад и несколько раз за пределами гриб (Таблица 1). В группах 0 h это произошло после того, как в колонии суб управления и два раза в зараженных колоний – во всех трех случаях поведение была исполнена основных рабочих. В одном случае несовершеннолетнего работника выплюнул дроплета в углу окна, и после основных рабочих сделал то же самое на лист Брамбл, оба в Escovopsis лечении. В колониях 72 h капелька регургитация на гриб был никогда не наблюдается в колониях управления но произошло семь раз в зараженных колониях. Шесть из них были основные рабочие и три из них одним человеком, добавил капель за пределами сада грибок. Споро прополки (рис. 3) и грибок прополки (рис. 3b) были низкие частоты. Хотя не было никаких значительных различий в частоте прополка между элементами управления и инфицированные колонии грибка, существует тенденция для прополки увеличить с момента инфицирования (F1,23= 2.91, p = 0.1014; Таблица 2). наши наблюдения сосредоточены на Escovopsis споро прополка, которые существенно не изменились со временем, но существует тенденция на более высокой частоте в колониях, инфицированных с Escovopsis чем в незараженных управления (F1,23 = 3,27, P = 0.0838; Таблица 2). меньше суб колоний, инфицированных Escovopsis была видна споры, оставшиеся после периода наблюдения с ранней стадии инфекции (когда муравьи были введены после 0 h споро прививки), с муравьями, удаляя все споры в почти половина из подпункта колоний (4 из 9; Рисунок 3 c). В поздней стадии инфекции (где муравьи были введены после 72 ч споро прививки), муравьи не были способны удаления споры полностью в любой из вложенных колоний. Взятые вместе, эти наблюдения предполагают тенденция муравьи перейти от споро, прополка прополка в течение инфекции грибок. Рисунок 3: частота прополка события. Значит, частота (± стандартные ошибки (SE); n = 9) () споро прополка ( Escovopsis спор) и (b) гриб, прополки (Escovopsis или другие грибы) в период наблюдения 4 h, сравнивая несовершеннолетних и специальностей от лечения групп, и (c) количество суб колоний с видимой Escovopsis спорами в группах лечения в конце периода наблюдения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Небольшие рабочие – управления Небольшие рабочие – лечение Основные рабочие – управления Основные рабочие – лечение 0h Гриб груминг 84 (9.333) 131 (14.56) 37 (4.111) 66 (7.333) Allogrooming 6 (0,6667) 14 (1.556) 5 (0.5556) 6 (0,6667) Споро прополка 0 3 0 5 (0.5556) Прополка гриб 0 0 0 0 Фекальный жидкости груминг 46 (5.111) 69 (7.667) 27 (3.000) 48 (5.333) Капелька приложения 0 0 1 (0.1111) 2 (0.2220) Метаплевральная железы уход 0 0 0 0 72h Гриб груминг 10 (1.429) 45 (5.000) 24 (3.429) 38 (4.222) Allogrooming 2 (0.2857) 10 (1.111) 1 (0.1110) 4 (0.4440) Споро прополка 0 0 0 1 (0.1110) Прополка гриб 0 1 (0.1110) 0 2 (0.2220) Фекальный жидкости груминг 19 (2.714) 38 (4.222) 30 (4.286) 30 (3.333) Капелька приложения 0 1 (0.1110) 0 6 (0,6667) Метаплевральная железы уход 0 2 (0.2220) 1 (0.1429) 1 (0.1110) Таблица 1 : Количество поведений в четыре часа наблюдения на 0 и 72 h после Escovopsis прививки. Среднее общее количество наблюдений (с средней частоты на единицу в скобках), сравнивая мелкие и крупные рабочие из управления и Escovopsis инфекции суб колоний, соответственно (n = 9). Тип 3 испытания фиксированных эффектов Гриб груминг Allogrooming Фекальный груминг Споро прополка Прополка гриб Эффекты Num DF Ден DF Значение F PR > F Num DF Ден DF Значение F PR > F Num DF Ден DF Значение F PR > F Num DF Ден DF Значение F PR > F Num DF Ден DF Значение F PR > F Колония 2 23 0,77 0.4733 2 23 0,52 0.5989 2 23 0.54 0.5903 2 23 0.51 0.6052 2 23 1.17 0.3272 Суб колония (колония) 6 23 0.93 0.4892 6 23 0.51 0.7978 6 23 0,63 0.7067 6 23 1,67 0.1742 6 23 1.53 0.2127 Лечение 1 23 2.8 0.1077 1 23 1.85 0,1875 1 23 0.6 0.4455 1 23 3.27 0.0838 1 23 1 0.3275 Время 1 23 6.53 0.0177 1 23 0.88 0.3574 1 23 0,97 0.3361 1 23 0,53 0.4742 1 23 2.91 0.1014 Таблица 2 : Смешанная ANOVA статистические результаты испытания на отдельные поведения, для которых Статистический анализ может быть выполнена. Фиксированных эффектов были колонии, суб колонии (вложенные в колонии), лечение и время. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. Видео 1: самостоятельного ухода и очистки антенны. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Щелкните правой кнопкой мыши скачать. Видео 2: гриб груминг. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Щелкните правой кнопкой мыши скачать. Видео 3: Allogrooming. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Щелкните правой кнопкой мыши скачать. Видео 4: метаплевральная железы груминг. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Щелкните правой кнопкой мыши скачать. Видео 5: Spore прополка. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Щелкните правой кнопкой мыши скачать. Видео 6: гриб прополка. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Щелкните правой кнопкой мыши скачать. Видео 7: фекальные жидкости груминг. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Щелкните правой кнопкой мыши скачать. Видео 8: капелька срыгивания. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Щелкните правой кнопкой мыши скачать.

Discussion

Основной целью данного исследования было наблюдать и записи характерные-листорезами муравей оборонительного поведения при наличии инфекции грибок сад с Escovopsis, создание клипов ссылки для использования широкой научной общественности. Следует отметить, что эти поведения не являются исключительными для обороны колоний от Escovopsis, но может также играть роль в обороне против других загрязнителей и инфекции⁶^,⁷^,,⁸^,⁹ ^,¹⁰^,¹¹^,¹²и в обороне муравьи сами⁴². Наш протокол служит фоном для более широкого исследования на оборону в выращивании гриба муравьи. Это может быть особенно полезным: (i) для молодых исследователей, которые не знакомы с эти поведения; (ii) для обеспечения последовательного определения и наблюдений поведения; (iii) для облегчения сравнения между исследования и виды муравьёв; (iv) поскольку ряд этих форм поведения может произойти так редко, даже опытные исследователи могут никогда не наблюдали их; (iv) потому что понимания и признания поведения в контролируемых условиях в лаборатории помощью исследования на месте где условия труднее контролировать.

Результаты нашего исследования поведенческих согласуются с предыдущей работы, который показал, что незначительные работников гриб жениха — решающее значение, если инфекция обнаружена рано — более крупные рабочие²⁵^,²⁸^,³². Здесь основных рабочих увеличилось количество грибковых уход после Escovopsis инфекции(рисунок 2). Это предполагает, что несовершеннолетних трудящихся являются преобладающим грибом парикмахеров, но что основные работники могут помочь в предотвращении распространения более создана инфекций. Более крупные рабочие можно удалить споры быстрее, в то время как несовершеннолетних работников может быть больше подходит для удаления менее доступной споры. Мы также обнаружили, что работники успешно удален споры в примерно половине из зараженных вложенных колоний (четыре из девяти), когда они были введены во время инфекции и таким образом могли обнаружитьвозбудителя ранних (рис. 3c). В целом, это указывает на ряд поведенческих реакций, где муравьи сначала попытаться остановить Escovopsis инфекции, удалив споры (и делают так что прежде чем инфекция распространяется), вместо удаления части сада гриб (рис. 3, б. ). Это со временем меняется, если инфекция прогрессирует, когда муравьи являются более вероятно удалить части гриба сад²⁸. Хотя наши выборки были слишком малы, чтобы быть убедительным, и мы не можем исключить, что одновременных инфекций вызванных прополки поведения, наши данные поддерживает эту тенденцию, с грибом, прополка, преимущественно присутствуя на более поздних стадиях инфекции (рис. 3 ). В целом низкий уровень гриб прополка предположить, что муравьи используются другие возражения (например, химикаты) далее подавляют рост Escovopsis, или что ни один из наших экспериментальных суб колоний были слишком сильно инфицированных (делая более разрушительные обороны ненужных).

Наши результаты показывают, что самостоятельного ухода с фекальными жидкость является характерным муравьев, ввод сада гриба и используется в качестве профилактической меры, вместо того, чтобы связанные с инфекцией. Аналогичные замечания были замечены в зиждительница самок, которые сами жених и передавать их ноги, фекальные капельки с их рот, при въезде в гнездо или обработки урожая²⁷. Инфекции в теории следует увеличить активность работников на краю гриба сада, если удалены зараженного материала осуществляется и сбросили в отвалах отходов. Следовательно фекальные жидкости уход также косвенно может увеличиваться в течение инфекции к минимуму распространения болезни. Мы бы ожидать Противоположная схема для тяжелых инфекций, с сокращением движение на краю гриба сада, как работников либо отказаться от гриба или принимать более экстремальные меры, например химической обороны.

В то время как фекальные жидкости могут служить важной профилактической химических для индивидуального, allogrooming используется гнездо товарищей на других рабочих если они обнаружить инородных частиц или микробы. Существенное различие наблюдается между частотой (Таблица 1) фекальных жидкости ухаживания (n = 304) и allogrooming (n = 48) может означать разницу в обнаружения патогена. Муравьи не способны легко обнаружить патогены на себя с их антенн; с другой стороны allogrooming делается гнездо-товарищей, которые может проверять все тело муравья и только выбрать жениха при необходимости. Поскольку Escovopsis является паразитом сад грибок, а не муравьи, это также может объяснить низкое количество allogrooming.

Мы редко наблюдаются метаплевральная железы, уход и лишь на более поздних стадиях инфекции. Видов выращивания гриба муравьи с обильным Pseudonocardia бактериальной крышкой жениха метаплевральная железы меньше видов с меньшим или нет покрытия²⁵^,⁴⁷. А. echinatior имеет обилие Симбионт⁴⁷, это может объяснить низкое железы уход частоты. Метаплевральная железы секреции также дорого производить³⁰и может храниться в течение infrabuccal карман для более длительных периодов времени, означает, что необходимо для ухода за метаплевральная железы могут быть нечастыми. Во время метаплевральная железы уход муравьи одновременно переключения ноги и лизать ноги, которые просто ухоженные железы; споры таким образом передаются infrabuccal карман, где секреции железы являются критическими для ингибирования Escovopsis‘ потенциал для последующего всхожесть²⁵. Небольшие рабочие более обильные внутри гнезда и имеют больше метаплевральная желез за единицу тела массы³⁰, предполагая, что они несут ответственность за большинство секреции железы метаплевральная. Это могло бы также объяснить, почему, в нашем исследовании, высокие частоты груминг гриб был среди несовершеннолетних работников.

Мы ожидали наблюдать behavior(s) указанием активного использования антибиотиков от бактериальных Симбионт Pseudonocardia, обычно наблюдается на кутикулу царицами рабочих и известный играть определенную роль в обороне против Escovopsis ³⁶ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰. наиболее вероятным объяснением за не соблюдение такого поведения, является, что применение этих антибиотики могут быть включены в другие поведения, такие как самостоятельного ухода следуют грибок груминг и/или прополка, который может сделать его трудно наблюдать как собственный поведение.

Мы наблюдали необычное поведение текущий жидких капель на грибок сад. Срыгивания пищи для nestmates ранее был описан в муравьями-листорезами²². В нашем эксперименте капельки отличались в цвете от прозрачного до темно-коричневого, предполагая, они могут быть источником пищи для других муравьев и/или воды. Мы только наблюдали два раза, где другие муравьи пили из капли, поэтому мы не можем определить, если капли пользу других муравьев, или служить увлажняет грибок при низкой влажности. Во время Escovopsis инфекций, которые могут подразумевать оборонительную роль, например иммунной грунтовки, срыгивания антимикробных пептидов¹⁶^,⁴⁸были большинство наблюдения этого поведения. Мы не можем выводы фирмы на этом поскольку это поведение было редким, но он будет интересную линию для дальнейшего расследования, например, путем определения ли капли имеют противомикробные свойства.

Учитывая что обсервационные исследования комплекс оборонительного поведения листьев резак муравьев, включая любые сравнения с и без сада инфекции грибок, будет чрезвычайно трудно сделать в области, экспериментальные данные могут предоставить ценную информацию о Эти поведения в более контролируемых условиях. Хотя замечания, сделанные в лабораторных условиях может отличаться от поведения, найдено в естественных условиях, инструменты, такие как наш каталог ключевой оборонительной поведения должны быть разработаны, чтобы улучшить как экспериментальный и полевых исследований в будущем. Экспериментальный подход может однако, частично объяснить, почему некоторые поведения были крайне редки (например, allogrooming, метаплевральная железы уход) в нашей демонстрации использования этих поведенческих определений. Будущих исследований может таким образом налагаются ограничения этой экспериментальной установки, чтобы найти способы сделать более естественным наблюдений. Дополнительные факторы также могут быть интегрированы в текущий протокол, например различия между актиномицеты несущие (младший) и пожилых работников с менее обильные крышкой, которая может по-разному реагировать на угрозу Escovopsis инфекции. Существует компромисс между делать замечания более точной (например, забив фокуса лиц), или имеющие больший размер суб колонии (большее количество трудящихся) и количество времени или количество суб колоний или лиц, которые могут быть сняты в данной момент времени. Тем не менее в то время как установка может быть продлено больше поведенческих исследований с упором на решении поведенческие цели, в этом случае мы сосредоточились на успешно демонстрации метода для записи и определения конкретных оборонительного поведения.

Мы документально поведения, которые способствуют обороны в муравьями-листорезами, и более значительно, систематически определили, описал и захватили оборонительного поведения на пленке. Наш представитель результаты укрепить другие исследования в этой области, о том, почему это трудно для патогена успешно заражать гриб земледелия муравей колонии, когда перед обширный набор оборонительного поведения и связанных с ними применение антимикробной соединений. Нашей главной целью было предоставить новый инструмент для будущей работы в этой области, и мы надеемся, что поведенческие каталог окажется ценным для обеспечения консенсуса и упрощенные определения, наблюдения и интерпретации поведения, чтобы служить в качестве важного ресурса для будущих исследований.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить линия Вэй Ugelvig и Кирстен Шихи для полезных обсуждений относительно груминг механизмов антенна уборщиков и съемки set-up. Майкл Поульсен поддерживается Виллум Канн Расмуссен молодой следователь стипендий (VKR10101) и Tabitha Иннокентий, Мари Кюри отдельных европейских стипендий (МЭФ Грант 627949). Мы также хотели бы поблагодарить институт Smithsonian для использования средств и материально-техническую поддержку в Панаме и администрация Nacional del Ambiente для разрешения собирать и экспортировать муравьи в Дании.

Materials

Plastic boxes	N/A	N/A	Transparent. Length: 3.15 in (8 cm), width: 2.17 in (5.5 cm), depth: 1.77 in (4.5 cm)
Petri dishes	Sarstedt	82.1472	3.62×0.63 in (9.2×1.6 cm)
Inoculation loops	Labsolute	7696431	Disposable 1uL. Length: 7.67 in (19.5 cm)
Cameras	DBPower	NTC50HD_8.5mm	USB Endoscope Camera
Holders for the cameras	N/A	N/A	Old beaker clamp stand.
Laptop	HP	N/A	Generic laptop for saving recordings.
Program used on the laptop	Windows Movie maker	N/A
Forceps	Vermandel	50.054	Soft
Potato dextrose broth	Sigma-Aldrich	P6685-1KG	24 g/L

References

Hölldobler, B., Wilson, E. O. . The ants. , (1990).
Weber, N. A. . Gardening ants, the attines. , (1972).
Bot, A. N. M., Ortius-Lechner, D., Finster, K., Maile, R., Boomsma, J. J. Variable sensitivity of fungi and bacteria to compounds produced by the metapleural glands of leaf-cutting ants. Insectes Sociaux. 49 (4), 363-370 (2002).
Poulsen, M., Boomsma, J. J. Mutualistic fungi control crop diversity in fungus-growing ants. Science. 307 (5710), 741-744 (2005).
Mueller, U. G., Scott, J. J., Ishak, H. D., Cooper, M., Rodrigues, A. Monoculture of Leafcutter Ant Gardens. Plos One. 5 (9), (2010).
Hughes, W. O. H., Thomsen, L., Eilenberg, J., Boomsma, J. J. Diversity of entomopathogenic fungi near leaf-cutting ant nests in a neotropical forest, with particular reference to Metarhizium anisopliae var. anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 85 (1), 46-53 (2004).
Samson, R. A., Evans, H. C., Latgé, J. -. P. . Atlas of entomopathogenic fungi. , (1988).
Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 413-423 (2003).
Hughes, D. P., Evans, H. C., Hywel-Jones, N., Boomsma, J. J., Armitage, S. A. O. Novel fungal disease in complex leaf-cutting ant societies. Ecological Entomology. 34 (2), 214-220 (2009).
Andersen, S. B., et al. The Life of a Dead Ant: The Expression of an Adaptive Extended Phenotype. American Naturalist. 174 (3), 424-433 (2009).
Currie, C. R., Mueller, U. G., Malloch, D. The agricultural pathology of ant fungus gardens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7998-8002 (1999).
Reynolds, H. T., Currie, C. R. Pathogenicity of Escovopsis weberi: The parasite of the attine ant-microbe symbiosis directly consumes the ant-cultivated fungus. Mycologia. 96 (5), 955-959 (2004).
Camargo, R. S., Forti, L. C., Lopes, J. F. S., Andrade, A. P. P., Ottati, A. L. T. Age polyethism in the leaf-cutting ant Acromyrmex subterraneus brunneus Forel, 1911 (Hym., Formicidae). Journal of Applied Entomology. 131 (2), 139-145 (2007).
Hughes, W. O. H., Sumner, S., Van Borm, S., Boomsma, J. J. Worker caste polymorphism has a genetic basis in Acromyrmex leaf-cutting ants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (16), 9394-9397 (2003).
Wilson, E. O. Caste and Division of Labor in Leaf-Cutter Ants (Hymenoptera, Formicidae, Atta). 2. The Ergonomic Optimization of Leaf Cutting. Behavioral Ecology and Sociobiology. 7 (2), 157-165 (1980).
Schmid-Hempel, P. Parasites and Their Social Hosts. Trends in Parasitology. 33 (6), 453-462 (2017).
Hamilton, W. D., Axelrod, R., Tanese, R. Sexual Reproduction as an Adaptation to Resist Parasites (a Review). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (9), 3566-3573 (1990).
Zhu, Y. Y., et al. Genetic diversity and disease control in rice. Nature. 406 (6797), 718-722 (2000).
Heine, D., et al. Chemical warfare between leafcutter ant symbionts and a co-evolved pathogen. Nature Communications. 9, (2018).
Cremer, S., Pull, C. D., Furst, M. A. Social Immunity: Emergence and Evolution of Colony-Level Disease Protection. Annual Review of Entomology. 63, 105-123 (2018).
Quinlan, R. J., Cherrett, J. M. Role of Substrate Preparation in Symbiosis between Leaf-Cutting Ant Acromyrmex octospinosus (Reich) and Its Food Fungus. Ecological Entomology. 2 (2), 161-170 (1977).
Richard, F. J., Errard, C. Hygienic behavior, liquid-foraging, and trophallaxis in the leaf-cutting ants, Acromyrmex subterraneus and Acromyrmex octospinosus. Journal of Insect Science. 9, (2009).
Reber, A., Purcell, J., Buechel, S. D., Buri, P., Chapuisat, M. The expression and impact of antifungal grooming in ants. Journal of Evolutionary Biology. 24 (5), 954-964 (2011).
Poulsen, M., Bot, A. N. M., Boomsma, J. J. The effect of metapleural gland secretion on the growth of a mutualistic bacterium on the cuticle of leaf-cutting ants. Naturwissenschaften. 90 (9), 406-409 (2003).
Fernandez-Marin, H., Zimmerman, J. K., Rehner, S. A., Wcislo, W. T. Active use of the metapleural glands by ants in controlling fungal infection. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 273 (1594), 1689-1695 (2006).
Fernandez-Marin, H., et al. Functional role of phenylacetic acid from metapleural gland secretions in controlling fungal pathogens in evolutionarily derived leaf-cutting ants. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), (2015).
Fernandez-Marin, H., Zimmermann, J. K., Wcislo, W. T. Nest-founding in Acromyrmexoctospinosus (Hymenoptera, Formicidae, Attini): demography and putative prophylactic behaviors. Insectes Sociaux. 50 (4), 304-308 (2003).
Currie, C. R., Stuart, A. E. Weeding and grooming of pathogens in agriculture by ants. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 268 (1471), 1033-1039 (2001).
Ortius-Lechner, D., Maile, R., Morgan, E. D., Boomsma, J. J. Metaplural gland secretion of the leaf-cutter ant Acromyrmex octospinosus: New compounds and their functional significance. Journal of Chemical Ecology. 26 (7), 1667-1683 (2000).
Poulsen, M., Bot, A. N. M., Nielsen, M. G., Boomsma, J. J. Experimental evidence for the costs and hygienic significance of the antibiotic metapleural gland secretion in leaf-cutting ants. Behavioral Ecology and Sociobiology. 52 (2), 151-157 (2002).
Bot, A. N. M., Currie, C. R., Hart, A. G., Boomsma, J. Waste management in leaf-cutting ants. Ethology Ecology & Evolution. 13 (3), 225-237 (2001).
Little, A. E. F., Murakami, T., Mueller, U. G., Currie, C. R. Defending against parasites: fungus-growing ants combine specialized behaviours and microbial symbionts to protect their fungus gardens. Biology Letters. 2 (1), 12-16 (2006).
Abramowski, D., Currie, C. R., Poulsen, M. Caste specialization in behavioral defenses against fungus garden parasites in Acromyrmex octospinosus leaf-cutting ants. Insectes Sociaux. 58 (1), 65-75 (2011).
Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).
Scheuring, I., Yu, D. W. How to assemble a beneficial microbiome in three easy steps. Ecology Letters. 15 (11), 1300-1307 (2012).
Worsley, S. F., et al. Symbiotic partnerships and their chemical interactions in the leafcutter ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecological News. 27, 59-74 (2018).
Currie, C. R., Poulsen, M., Mendenhall, J., Boomsma, J. J., Billen, J. Coevolved crypts and exocrine glands support mutualistic bacteria in fungus-growing ants. Science. 311 (5757), 81-83 (2006).
Poulsen, M., et al. Variation in Pseudonocardia antibiotic defence helps govern parasite-induced morbidity in Acromyrmex leaf-cutting ants. Environmental Microbiology Reports. 2 (4), 534-540 (2010).
Poulsen, M., Cafaro, M., Boomsma, J. J., Currie, C. R. Specificity of the mutualistic association between actinomycete bacteria and two sympatric species of Acromyrmex leaf-cutting ants. Molecular Ecology. 14 (11), 3597-3604 (2005).
Andersen, S. B., Hansen, L. H., Sapountzis, P., Sorensen, S. J., Boomsma, J. J. Specificity and stability of the Acromyrmex-Pseudonocardia symbiosis. Molecular Ecology. 22 (16), 4307-4321 (2013).
Currie, C. R., Bot, A. N. M., Boomsma, J. J. Experimental evidence of a tripartite mutualism: bacteria protect ant fungus gardens from specialized parasites. Oikos. 101 (1), 91-102 (2003).
Cremer, S., Armitage, S. A. O., Schmid-Hempel, P. Social immunity. Current Biology. 17 (16), R693-R702 (2007).
Schluns, H., Crozier, R. H. Molecular and chemical immune defenses in ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecological News. 12, 237-249 (2009).
Masri, L., Cremer, S. Individual and social immunisation in insects. Trends in Immunology. 35 (10), 471-482 (2014).
Hackmann, A., Delacave, H., Robinson, A., Labonte, D., Federle, W. Functional morphology and efficiency of the antenna cleaner in Camponotus rufifemur ants. Royal Society Open Science. 2 (7), (2015).
. How ants use ‘combs’ and ‘brushes’ to keep their antennae clean Available from: https://www.youtube.com/watch?time_continue=65&v=AB4HoeloqZw (2015)
Fernandez-Marin, H., Zimmerman, J. K., Nash, D. R., Boomsma, J. J., Wcislo, W. T. Reduced biological control and enhanced chemical pest management in the evolution of fungus farming in ants. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 276 (1665), 2263-2269 (2009).
Konrad, M., et al. Social Transfer of Pathogenic Fungus Promotes Active Immunisation in Ant Colonies. Plos Biology. 10 (4), (2012).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Nilsson-Møller, S., Poulsen, M., Innocent, T. M. A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants. J. Vis. Exp. (140), e58420, doi:10.3791/58420 (2018).

Automatically Generated