A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants

Stephen Nilsson-M&#248;ller; Michael Poulsen; Tabitha M. Innocent

doi:10.3791/58420

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Behavior

Um guia Visual para estudar as defesas comportamentais para patógeno ataca em formigas cortadeiras

Published: October 12, 2018

doi:

10.3791/58420

Stephen Nilsson-Møller¹, Michael Poulsen¹, Tabitha M. Innocent¹

¹Centre for Social Evolution, Section for Ecology and Evolution, Department of Biology,University of Copenhagen

Summary

Nós apresentamos um guia visual para comportamentos de defesa de doença em formigas cortadeiras, com grampos individuais e definições de acompanhamento, ilustradas em um cenário de infecção experimental. Nosso principal objetivo é ajudar outros pesquisadores a reconhecer comportamentos defensivos chaves e fornecer um entendimento comum para futuras pesquisas neste campo.

Abstract

O estilo de vida complexo, história evolutiva da cooperação avançada e as defesas de doença de formigas cortadeiras são bem estudados. Apesar de numerosos estudos descreveram os comportamentos relacionados com a defesa da doença e o uso associado de substâncias químicas e agentes antimicrobianos, não foi feita nenhuma referência visual comum. O principal objetivo deste estudo foi gravar clipes curtos de comportamentos envolvidos na defesa da doença, tanto de forma profilática e diretamente dirigida a um antagonista da colônia após a infecção. Para isso usamos um experimento de infecção, com sub colônias das espécies de formigas cortadeiras Acromyrmex echinatiore a ameaça de patogenicidade conhecida mais significativa para cultura fúngica das formigas (Leucoagaricus gongylophorus), um especializados fungo patogênico do género Escovopsis. Nós filmado e comparado colónias infectadas e não infectadas, em fases iniciais e mais avançadas da infecção. Podemos quantificar comportamentos defensivos chaves através de tratamentos e mostrar que a resposta comportamental ao ataque de patógeno provável varia entre diferentes castas de formigas do trabalhador e deteção precoce e tardia de uma ameaça. Com base nestas gravações que fizemos uma biblioteca de clipes comportamentais, acompanhado pelas definições dos principais comportamentos defensivos individuais. Antecipamos que tal um guia pode fornecer um quadro comum de referência para outros pesquisadores que trabalham neste campo reconhecer e estudar esses comportamentos e também proporcionar maior margem de comparação entre diferentes estudos para, finalmente, ajudar a entender melhor o papel esses comportamentos jogam na defesa da doença.

Introduction

As formigas cortadeiras são avançadas insetos sociais, formando algumas das colónias mais complexas na terra. Eles são um ramo derivado das formigas fungo-crescentes (tribo Attini) consistindo de dois gêneros Acromyrmex e Atta¹. Eles cultivam as espécies de culturas fúngicas Leucoagaricus gongylophorus (Basidiomycota: Agaricales), que dependem de como sua fonte de alimento principal²^,³. As formigas fornecem este fungo com material da folha fresca para o seu crescimento, e o fungo produz em troca nutriente-ricos inchadas hifas dicas (gongylidia) que são consumidas por formigas e sua ninhada. Colônias são construídas no subsolo, a cultura fúngica é mantida em jardins externos⁴^,⁵, e os agricultores de formiga proteger sua monocultura lavoura de potenciais patógenos⁶^,⁷^,⁸ ^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Colónias dividam o trabalho entre trabalhadores de diferentes tamanhos (casta) e idade¹³^,¹⁴^,¹⁵, que se estende para a defesa das formigas e das culturas de organismos patogénicos.

Esperamos que as colónias de formigas cortadeiras devem ser vulneráveis à doença. Grupo viver é esperado para facilitar a disseminação de doenças entre trabalhadores relacionados devido às interações frequentes e, assim, mais fácil de transmissão¹⁶. As formigas são suscetíveis a parasitas, fungos entomopatogénicos, como espécies de Metarhizium e Beauveria bassiana⁶. Estes parasitas são generalistas e muitas vezes estão presentes no solo próximo a ninhos de⁷^,⁸. Cultivo da safra de fungo como uma monocultura⁴^,⁵ torna provável que também seja suscetível à doença¹⁷^,¹⁸. Ele pode estar infectado por parasitas fúngicos de generalista (incluindo espécies de Aspergillus niger e Trichoderma ³); no entanto, a ameaça a mais significativa é um fungo de necrotrophic especialista no género Escovopsis (Ascomycota: Hypocreales)¹¹. Através da secreção de enzimas mycolytic e outros compostos, Escovopsis mata e obtém nutrientes do fungo colheita¹², com consequências potencialmente fatais para as colônias de formiga¹¹^,¹⁹.

Para combater ameaças de doenças, as formigas têm defesas notáveis no nível tanto individual como colônia, controle biológico de combinação, defesas químicas e comportamentais para agir profilaticamente e, quando necessário, em resposta à infecção. Coletivamente, estas defesas, prevenir ou reduzem o impacto das infecções de agentes patogénicos generalistas e especialistas tais como Escovopsis. Em geral, eles envolvem evitando a contração de parasitas no ambiente²⁰, prevenção de parasitas de entrar no ninho, de limitar a propagação da infecção dentro de ninhos. As primeiras linhas de defesa incluem produtos químicos de secreções glandulares³^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^, ²⁷ de desinfectar substratos vegetais, através de trabalhadores, lambendo-os antes da incorporação no jardim de fungo e formigas, realização de autoe allogrooming. Quando enfeitando-se, especialmente ao entrar no ninho, os trabalhadores podem igualmente aplicar ácidas secreções fecais a seu corpo²⁷. Estas defesas profiláticas são comprovadamente importantes para evitar a infecção por ameaças patogênicos⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^, ¹².

Se as defesas iniciais falharem e um patógeno como Escovopsis êxito na entrada do ninho e o jardim de fungo, e se a infecção for detectada numa fase inicial, as formigas usam fungo aliciamento para remover esporos²⁵^,²⁸_. As formigas podem aplicar as secreções das glândulas metapleural ou transferir os esporos para o bolso de infrabuccal (uma cavidade oral), onde eles são misturados com um coquetel químico contendo de secreções de glândula metapleural e labial²⁶. Há mais de 20 compostos conhecidos nestas glândulas, incluindo carboxílico de γ – ceto-,- e indoleactic ácidos³. Estas são ativamente aplicado²⁵, tem propriedades antibióticas, fungistático e fungicida²⁹e podem inibir de germinação de esporos de Escovopsis ³⁰. Esporos armazenados no bolso infrabuccal são expelidos mais tarde fora da colônia³¹^,³². A maioria deste fungo aliciamento após detecção de fase inicial é realizada por trabalhadores menores de²⁸^,³³. No entanto, se um patógeno gerencia evitar a detecção e espalha-se no interior do jardim de fungo, tanto trabalhadores menores e principais partes infectadas do fungo²⁸de erva, e este material removido é depositado fora do ninho,³¹. Além disso, a espécie do género de cortadeiras Acromyrmex usar controle biológico na forma de antibióticos produzidos por simbiótica Actinobacteria³⁴^,³⁵^,³⁶— mantida na a formiga cutícula³⁷de predominantemente jovens trabalhadores principais³⁴^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰— para produzir compostos que impedem o crescimento micelial de Escovopsis ³⁴ ^, ³⁸ ^, ⁴¹. esta produção de antibióticos por sua vez pode ser prejudicada pela Escovopsis-produzido compostos durante uma infecção,¹⁹.

Figura 1: características morfológicas Ant. Um desenho esquemático do formiga mostrando as estruturas morfológicas mencionadas no protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Defesas de formigas cortadeiras constituem, portanto, um conjunto integrado de mecanismos comportamentais e químicos que fornecem coletivamente estas formigas com muito eficiente proteção contra doença⁴². Compreender essas defesas é de amplo interesse, e eles têm sido extensivamente pesquisado¹⁶^,²⁰^,⁴²^,,⁴³^,⁴⁴. No entanto, uma compilação visual dos comportamentos defensivos que ajudaria a definição inequívoca e descrevê-los para utilização sistemática pelos pesquisadores é, a nosso conhecimento, não está disponível. Embora a terminologia utilizada para descrever o comportamento da formiga é relativamente padronizada, não há, portanto, nenhuma certeza de que os mesmos atos comportamentais são nomeados consistentemente em diferentes estudos. Aqui, o nosso principal objetivo é remediar esta situação, proporcionando clareza e padronização através de uma compilação de gravações em vídeo de comportamentos de profiláticas e defensiva individuais acompanhado de definições associadas. Nós filmamos esses clipes durante um experimento comportamental, em que observada e quantificada comportamentos no contexto de infecções experimentais de Escovopsis das colônias sub Acromyrmex echinatior , cujos resultados também apresentamos aqui como um exemplo ilustrativo de como esta compilação pode ser usada para estudos comportamentais.

Protocol

1. isolamento de Escovopsis Isole Escovopsis cepas de colônias de laboratório Acromyrmex echinatior , colocando-se fragmentos de jardim de fungo, com formigas removidas, sobre uma placa de Petri com algodão úmido por vários dias até Escovopsis germina e sporulates. Transferência de esporos para placas de ágar batata dextrose (PDA, 39 g/L) e incubar a ca. 23° C, por aproximadamente duas semanas.Nota: Uma estirpe foi usada no estudo atual. Use uma agulha estéril para escolher esporos maduros destas primeiras placas. Escolha a esporos suficiente para cobrir a ponta da agulha. Inoculação de esporos em novas placas em condições estéreis e incubar a ~ 23 ° C, por aproximadamente duas semanas. Quando hifas tem coberto o prato inteiro e crescido em esporos castanhos maduros, repita a etapa 1.3, mas desta vez com esporos da placa de novo PDA. Repita o processo até um estoque limpo de Escovopsis para cada estirpe é adquirida (sem contaminantes visíveis crescendo na ou abaixo da superfície da placa). 2. experimental set-up Use três colônias da . echinatior .Nota: Aqui as colônias Ae160b, Ae322 e Ae263 foram usadas. Em cada colônia, fazer 12 colônias sub. Fazer seis colônias sub para observação após 0 h e seis colônias sub para observação após 72 h. Isso dá um total de 36 colônias sub; Marque a metade das colônias de cada colônia de ‘pai’ como controle e a outra metade como ‘TratamentoEscovopsis’ sub.Nota: Embora em colônias de pai a presença de uma rainha afeta o comportamento do trabalhador, esperamos (embora isso não pode ser garantido), que rainha-menos sub colônias podem comportar-se como colônias de queenright para o curto período de tempo que é executado o experimento. Para cada colônia sub, use uma caixa quadrada de comprimento: ~ em 3,15 (8 cm), largura: ~ em 2,17 (5,5 cm) e profundidade ~ em 1,77 (4,5 cm).Nota: O ponto importante é fornecer espaço suficiente para formigas fora o fragmento do fungo para forragem e despejar o lixo, mas ao mesmo tempo fazer a caixa pequena o suficiente que a filmagem e o comportamento de reconhecimento é viável. Para cada colônia sub, adicionar um pedaço de-colher de chá de tamanho (cerca de 2,2 cm3 e 1,2 g) da parte central do jardim do fungo (L. gongylophorus) da colônia original, um par de folhas de amora, e um pedaço de algodão embebido em água.Nota: O algodão hidrófilo fornece umidade. Ele não deve estar pingando água e não deve tocar no jardim de fungo. Para sub colônias tratadas com Escovopsis, use um laço do inoculation e encher a abertura então é coberto apenas por Escovopsis esporos. Inocule os esporos tocando suavemente uma parte pequena, localizada no jardim de fungo dez a vinte vezes para que os esporos não são também agrupados. Para colônias sub utilizadas como controles, imitam a aplicação de Escovopsis para o jardim de fungo com um laço do inoculation estéril.Nota: Embora este não foi feito no presente experimento, a inoculação de um pó estéril (como grafite ou pó de talco) pode ser feita nesta fase para diferenciar entre uma infecção com um patógeno e um agente inerte. Para observações de 72 h, deixe metade das colônias sub (controla e infectado) por 72 h após a introdução do Escovopsis antes de adicionar as formigas ou iniciar a gravação de vídeo.Nota: À espera de 72 h na ausência de formigas torna provável que Escovopsis esporos germinarão (inéditos em vitro dados); Embora isto também aumenta a chance de outras infecções (por exemplo, de um fungo já presente no jardim de fungo), este período de tempo é preferível que este tratamento representar a fase inicial da infecção estabelecida. Para observações de 0 h, diretamente após a etapa 2.6 e cerca de 30 min antes da gravação, adicione ninhada de dois, quatro trabalhadores menores e quatro grandes trabalhadores simultaneamente da colônia pai para cada caixa. Use dois grandes trabalhadores de dentro do jardim que são jovens com pigmentos de luz, com Actinobacteria cobrindo a maioria da cutícula. Leve os outros dois de fora do jardim, com pigmento escuro e Actinobacteria apenas cobrindo as placas laterocervical. Para observações de 72 h, repita 2.8 e 2.8.1 em 30 min antes da gravação, ou seja, 71,5 h após inoculação com Escovopsis.Nota: As colónias de sub Experimental são significativamente menores do que estabelecido colônias de Acromyrmex naturais. Isto é necessário para gravar com precisão o comportamento. Enquanto isso pode influenciar a frequência de alguns comportamentos qualitativamente, a composição das colônias sub foi escolhida para refletir a mistura de trabalhadores nas colônias naturais mais provável qualitativamente refletir as interações comportamentais. 3. gravação e marcando comportamentos Usar um endoscópio USB conectado a um laptop (ou equivalente) e fornecer luz suficiente. Para cada colônia sub, execute a gravação de vídeo de 4 h (a partir de 0 h ou pós-infecção 72 h). Depois de gravar as 36 colônias sub, rever o total de 144 h de filmagem e pontuação todos os comportamentos de interesse para todos os indivíduos em cada colônia sub.Nota: No exemplo experimental atual, tivemos que excluir duas colónias sub (um controle da colônia Ae160b) e uma colônia de tratamento secundário da colônia Ae322 devido a infecção por fungos que não sejam Escovopsis, reduzindo o número total de horas de observações a 136. Cada vez que um comportamento é observado, gravá-lo como 1 ocorrência.Nota: Um comportamento pode ser de curta ou longa duração, mas apenas a pontuação–> 1 se é interrompido por outro comportamento, ou se a formiga é passiva, por um período de tempo. 4. comportamentos Nota: As definições comportamentais foram feitas usando uma combinação de descrições anteriores estudos23,,27,28,31,45 e observações pessoais. Para uma ilustração detalhada, apresentando estruturas morfológicas importantes utilizadas no protocolo para reconhecimento de comportamentos, consulte a Figura 1. Auto aliciamento e antena de limpeza (Vídeo 1) Observe se a formiga para o movimento da perna para iniciar auto aliciamento. Verificar que as antenas são puxadas através os limpadores de antena sobre as patas dianteiras (Figura 1), uma estrutura de braçadeira localizada na articulação tíbia-Tarso consistindo de um entalhe enfrentando um esporão com diferentes tamanho de cerdas e pentes45, 46. Após a limpeza da antena, observe que a formiga vai limpar as pernas e os limpadores de antena, puxando as pernas com o aparelho bucal, remoção de partículas e potenciais patógenos com a glossa (Figura 1).Nota: Self grooming pode consistir de limpeza da antena e, posteriormente, os limpadores de antena (Figura 1), mas também usando aparelho bucal para limpar os pés. Quando uma formiga está limpando suas pernas, mais frequentemente limpa todas as seis pernas em sucessão. Fungo aliciamento (vídeo 2) Observe se a formiga para os movimentos da perna em um ponto fixo no jardim de fungo. Observar que as antenas são paralelas e imóvel apontado para o fungo para que o ângulo entre o escapo e cordão (Figura 1) é de aproximadamente 45 °, e a ponta das antenas são quase tocar uns aos outros, próximo as pontas do (mandíbulas A Figura 1). Note-se que o superior (maxilares) e inferior peças bucais (labium) estão abertas, com a glossa (Figura 1) emergentes de lamber o fungo. Allogrooming (vídeo 3) Observe esse comportamento quando um ou mais formigas abordaram outra formiga (destinatário) ou vice-versa. Durante o comportamento, as formigas Parem o movimento e ficar estreitamente com contato físico. O aliciamento ant(s) pode mover-se ligeiramente cobrir uma área maior do corpo da formiga destinatário. Observe que as antenas dos perseguidores podem ser imóvel e apontou em direção um ponto específico do recebimento de formiga ou movendo-se e batendo levemente o receptor. O ângulo entre a paisagem e o funículo (Figura 1) é de aproximadamente 45 °, dependendo se eles são fixos em um ponto específico ou batida. As pontas das antenas do ator são geralmente perto um do outro e as pontas das mandíbulas (Figura 1). Note-se que o superior (maxilares) e inferior peças bucais (labium) estão abertas, com a glossa (Figura 1) emergentes para lamber a formiga do receptor. Aliciamento de glândula Metapleural (Video 4) Observe quando a formiga para o movimento iniciar metapleural aliciamento de glândula (Figura 1). Observe que a formiga se inclina para o lado para chegar a uma de suas costas pernas dianteiras para esfregar a abertura (meato) da glândula metapleural (por exemplo, a perna dianteira direita).Nota: A outra perna da frente é simultaneamente (neste exemplo a perna da frente esquerda) lambido pela glossa (Figura 1). Verificar que a formiga se inclina para o lado oposto e alterna as pernas e repete o mesmo movimento com as pernas opostas. A formiga continua a mover as pernas dianteiras para as glândulas metapleural e, posteriormente, para a glossa constantemente alternando entre as pernas (Figura 1).Nota: Neste exemplo, a formiga agora passará a perna esquerda da frente para a glândula metapleural e a perna dianteira direita para a glossa (Figura 1). Depois da glândula metapleural (Figura 1) aliciamento, a formiga inicia frequentemente self aliciamento (passo 4.1). Esporos de remoção de ervas daninhas (Video 5) Observe esse comportamento quando a formiga para os movimentos da perna em um ponto fixo no jardim do fungo. Observe que as antenas são imóvel e paralelos, apontando para o fungo para que o ângulo entre a paisagem e o funículo é de aproximadamente 45°, e as pontas das antenas são quase tocar um ao outro e as pontas das mandíbulas (Figura 1). Verifica que a formiga abre suas mandíbulas (Figura 1) para agarrar visível Escovopsis esporos e desanexá-los da cultura fúngica, puxando-os para fora. A formiga carrega o cluster de esporos fora do ninho, enquanto as antenas são suavemente em movimento para orientação. As antenas podem ser limpas através os limpadores de antena (Figura 1; Veja vídeo 1), mantendo o cluster de esporos. A formiga cai os esporos em uma pilha de lixo.Nota: Gravação de atividade em torno da pilha do lixo não foi feita na experiência atual, mas seria uma extensão apropriada do protocolo atual. Fungo capina (6 de vídeo) Observe esse comportamento quando a formiga para os movimentos da perna em um ponto fixo do fungo. As antenas são vagamente apontou em direção à parte do fungo que a formiga é a tentativa de remover, enquanto batendo levemente o pedaço de fungo. Observe que a formiga usa suas mandíbulas para qualquer corte através da cultura fúngica para desanexar uma área especificada, ou pegar uma parte da peça fungo com suas mandíbulas (Figura 1). A formiga simultaneamente vai balançar de um lado para o outro em suas pernas, enquanto ele puxa o pedaço de fungo.Nota: Remoção de ervas daninhas pode ser feita por vários trabalhadores e por menores e majores. Se, então, algumas formigas façam o corte de fungo, outros realizar o balanço e movimento de puxar. A parte destacada do fungo é feita fora do ninho e deixou na pilha do lixo. Gravação do depósito resíduos não foi feita na experiência atual, mas seria uma extensão apropriada do protocolo atual. Fluido fecal aliciamento (vídeo 7) Observe esse comportamento quando a formiga para os movimentos da perna em um ponto fixo no jardim do fungo. A formiga se dobra seu gaster (Figura 1) e a cabeça em direção ao outro para aplicar uma gota do líquido fecal para o aparelho bucal. Observe que a formiga puxa as pernas dianteiras através as mandíbulas (Figura 1), um de cada vez. Posteriormente, a formiga move as antenas através os limpadores de antena (Figura 1), localizados na articulação tíbia-Tarso das pernas dianteiras. Regurgitação da gota (Video 8) Observe esse comportamento quando a formiga para os movimentos da perna em um ponto fixo do fungo. As antenas são imóvel e paralelos, apontando para o fungo para que o ângulo entre a paisagem e o funículo é de aproximadamente 45°, e as pontas das antenas quase se tocam e as pontas das mandíbulas (Figura 1). Observe que a formiga regurgita uma gotícula de líquido para o fungo, variando de ser transparente à luz amarela ou até marrom, de seu aparelho bucal.

Representative Results

O principal objetivo deste estudo foi a criação de clipes curtos que ilustram comportamentos associados com a defesa da doença em formigas cortadeiras, para gerar um catálogo a ser usado como referência para futuros estudos. Além disso, o estudo usa um exemplo de uma instalação experimental dentro do qual estes comportamentos foram quantificados para mostrar como este catálogo pode ser usado em estudos comportamentais, que cujos resultados representativos resumimos aqui. Sub-Colonies foram criados para observação em fase inicial (0 h) e tarde palco (72 h) de infecção. Devido às pesadas infecções com fungos que não sejam Escovopsis após 72 h, duas colônias sub (um controle para colônia Ae160b) e um tratamento para a colônia Ae322 foram excluídas, então podemos focar a apresentação dos resultados do ponto de tempo de 0 h e colocar menos ênfase comportamentos observados após 72 h. Depois de filmar todas as colônias sub e marcando os comportamentos defensivos, encontramos diferenças nos padrões de comportamento associados com o tempo após a infecção e contexto, incluindo as diferentes formas em que eles eram usados pelos trabalhadores de pequenos e grandes. Em contraste, Self aliciamento foi feito em todos os momentos em tanto controle e colônias sub infectadas. Também era comum quando as formigas estavam buscando e tentar remover, Escovopsis hifas ou esporos. Porque esse comportamento foi tão universalmente observados e frequente em todas as situações, nós não quantificá-lo. Nós marcamos todos os outros comportamentos descritos no protocolo e no presente calculado total média de frequências e para pequenos e grandes trabalhadores por sub colônia (tabela 1). Descobrimos que em controles, trabalhadores menores preparado o jardim das culturas mais do que grandes trabalhadores (Figura 2a), em curiosamente observaram que passassem mais tempo no jardim de fungo. Nas colônias infectadas com Escovopsis , houve uma tendência para aumento do fungo grooming geral relativo para colônias de controle, mas isto não foi significativo (F1,23 = 2,80, p = 0.1077; Tabela 2; Figura 2 um). houve um aumento não significativo no aliciamento fecal com infecção (F1,23 = 0,60, p = 0.4455; Tabela 1) mas não há diferença entre pequenos e grandes trabalhadores (Figura 2b). Observamos fecais aliciamento quando trabalhadores entraram o fungo, ao invés de quando eles estavam na ou completamente longe do fungo durante longos períodos de tempo. Figura 2: frequência de eventos de aliciamento. Número (± erros-padrão (SE); n = 9) (a) fungo aliciamento e (b) fecal de fluido de aliciamento eventos dentro de quatro horas após a inoculação, comparando os trabalhadores menores e principais controles e tratamentos Escovopsis . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Vários comportamentos eram extremamente raros. Observamos apenas a glândula metapleural aliciamento quatro vezes, e todas as instâncias ocorreram após 72 h; vez no grupo controle e três vezes em colônias com infecção Escovopsis (tabela 1). Quase tão raramente, encontramos que as formigas que regurgitam uma gotícula de líquido para o jardim de fungo e algumas vezes fora do fungo (tabela 1). Nos grupos de h 0, isso aconteceu uma vez em uma colônia de sub controle e duas vezes em colônias infectadas – em todas as três instâncias do comportamento foi realizado por um grande trabalhador. Em uma ocasião um trabalhador menor regurgitados uma gota no canto da caixa, e uma vez que um grande trabalhador fez o mesmo em uma folha de amora, ambos no tratamento Escovopsis . Das colônias de 72 h, regurgitação da gota sobre fungos nunca foi observada nas colônias controle mas aconteceu sete vezes em colônias infectadas. Seis destes eram trabalhadores principais e três por um único indivíduo que adicionou as gotas fora do jardim de fungo. Esporo remoção de ervas daninhas (Figura 3a) e fungo remoção de ervas daninhas (Figura 3b) foram ambos de baixa frequência. Enquanto não houve diferença significativa na frequência de fungos para remoção de ervas daninhas entre colônias infectadas e controles, houve uma tendência para remover ervas daninhas para aumentar com o tempo desde a infecção (F1,23= 2,91, p = 0.1014; Tabela 2). nossas observações focada em spore Escovopsis remoção de ervas daninhas, que não alterou significativamente com o tempo, mas houve uma tendência para uma maior frequência nas colônias infectadas com Escovopsis do que em controles não infectados (F1,23 = 3,27, P = 0.0838; Tabela 2). menos colônias sub infectadas com Escovopsis tinham esporos visíveis remanescentes após o período de observação com uma fase inicial de infecção (quando as formigas foram introduzidas após 0 h de inoculação de esporos), com formigas, removendo todos os esporos em quase metade das colônias sub (4 de 9; Figura 3 c). em infecções de estágio posteriores (onde as formigas foram introduzidas após 72 h de inoculação de esporos), as formigas não foram capazes de remover os esporos completamente em qualquer das colônias sub. Tomados em conjunto, estas observações sugerem uma tendência para as formigas deslocar do esporo capina para remoção de ervas daninhas ao longo de uma infecção de fungos. Figura 3: frequência de capina eventos. Quer dizer a frequência (± erros-padrão (SE); n = 9) do (a) esporo remoção de ervas daninhas (de esporos de Escovopsis ) e (b) fungo capina (Escovopsis ou outros fungos) durante um período de observação de 4 h, comparando os menores e majores dos grupos de tratamento, e (c) o número de colônias sub com esporos visíveis de Escovopsis em grupos de tratamento no final do período de observação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Trabalhadores menores – controle Trabalhadores menores – tratamento Grandes trabalhadores – controle Grandes trabalhadores – tratamento 0h Fungo aliciamento 84 (9.333) 131 (14,56) 37 (4.111) 66 (7.333) Allogrooming 6 (0.6667) 14 (1,556) 5 (0.5556) 6 (0.6667) Esporos de capina 0 3 0 5 (0.5556) Fungo capina 0 0 0 0 Aliciamento de fluido fecal 46 (5.111) 69 (7.667) 27 (3.000) 48 (5.333) Aplicação da gota 0 0 1 (0.1111) 2 (0.2220) Aliciamento de glândula Metapleural 0 0 0 0 72h Fungo aliciamento 10 (1.429) 45 (5.000) 24 (3.429) 38 (4.222) Allogrooming 2 (0.2857) 10 (1,111) 1 (0.1110) 4 (0.4440) Esporos de capina 0 0 0 1 (0.1110) Fungo capina 0 1 (0.1110) 0 2 (0.2220) Aliciamento de fluido fecal 19 (2.714) 38 (4.222) 30 (4.286) 30 (3.333) Aplicação da gota 0 1 (0.1110) 0 6 (0.6667) Aliciamento de glândula Metapleural 0 2 (0.2220) 1 (0.1429) 1 (0.1110) Tabela 1 : O número de comportamentos em 4 horas de observação em 0 e 72 h após Escovopsis inoculação. O número médio total de observações (com frequências médios por indivíduo entre parênteses), comparando os trabalhadores menores e principais de controle e Escovopsis infecção sub colônias, respectivamente (n = 9). Ensaios de tipo 3 dos fixos-efeitos Fungo aliciamento Allogrooming Aliciamento fecal Esporos de capina Fungo capina Efeitos Num DF Den DF Valor de F PR > F Num DF Den DF Valor de F PR > F Num DF Den DF Valor de F PR > F Num DF Den DF Valor de F PR > F Num DF Den DF Valor de F PR > F Colônia 2 23 0,77 0.4733 2 23 0,52 0.5989 2 23 0,54 0.5903 2 23 0,51 0.6052 2 23 1.17 0.3272 Subcolônia (Colônia) 6 23 0.93 0.4892 6 23 0,51 0.7978 6 23 0,63 0.7067 6 23 1.67 0.1742 6 23 1.53 0.2127 Tratamento 1 23 2.8 0.1077 1 23 1.85 0.1875 1 23 0.6 0.4455 1 23 3.27 0.0838 1 23 1 0.3275 Tempo 1 23 6.53 0.0177 1 23 0,88 0.3574 1 23 0,97 0.3361 1 23 0,53 0.4742 1 23 2.91 0.1014 Tabela 2 : Resultados estatísticos da ANOVA mista testes em comportamentos distintos no qual podem efectuar-se análises estatísticas. Efeitos fixos foram colônia, colônia sub (aninhado dentro de Colônia), tratamento e tempo. Clique aqui para baixar esta tabela. Video 1: Self aliciamento e antena limpeza. Por favor clique aqui para ver este vídeo. Botão direito do mouse para baixar. Video 2: fungo aliciamento. Por favor clique aqui para ver este vídeo. Botão direito do mouse para baixar. Vídeo 3: Allogrooming. Por favor clique aqui para ver este vídeo. Botão direito do mouse para baixar. Video 4: aliciamento de glândula Metapleural. Por favor clique aqui para ver este vídeo. Botão direito do mouse para baixar. Video 5: remoção de ervas daninhas Spore. Por favor clique aqui para ver este vídeo. Botão direito do mouse para baixar. Vídeo 6: fungo capina. Por favor clique aqui para ver este vídeo. Botão direito do mouse para baixar. Video 7: aliciamento fluido Fecal. Por favor clique aqui para ver este vídeo. Botão direito do mouse para baixar. Video 8: regurgitação Droplet. Por favor clique aqui para ver este vídeo. Botão direito do mouse para baixar.

Discussion

O objetivo principal deste estudo foi observar e registro característico cortadeiras formiga comportamentos defensivos na presença de infecção do fungo-jardim com Escovopsis, criação de clipes de referência para usam pela comunidade científica mais ampla. Note-se que esses comportamentos não são exclusivos para a defesa das colónias de Escovopsis, mas também pode desempenhar um papel na defesa contra outros contaminantes e infecções⁶^,⁷^,⁸^,⁹ ^,¹⁰^,¹¹^,¹²e na defesa das formigas se⁴². Nosso protocolo fornece um pano de fundo para a pesquisa mais ampla sobre defesas em fungo-crescentes formigas. É provável que seja particularmente útil: (i) para jovens investigadores que não estão familiarizados com esses comportamentos; (ii) para fixar as definições consistentes para e observações de comportamentos; (iii) para facilitar as comparações entre estudos e espécies de formigas; (iv) porque um número destes comportamentos pode ocorrer tão raramente que nem experimentou pesquisadores podem nunca ter observado (iv) porque compreender e reconhecer comportamentos em condições controladas na ajuda do laboratório de estudos em situ onde as condições são mais difíceis de controlar.

Os resultados do nosso estudo comportamental são consistentes com o trabalho anterior, que mostrou que menores trabalhadores fungo noivo — crucial se uma infecção for detectada cedo — mais de grandes trabalhadores²⁵^,²⁸^,³². Aqui, grandes trabalhadores aumentaram a quantidade de fungos aliciamento após infecção Escovopsis (Figura 2a). Isto sugere que os trabalhadores menores são groomers fungo predominante, mas que grandes trabalhadores podem ser úteis para impedir a propagação de mais estabeleceram infecções. Os trabalhadores de grandes maiores podem remover esporos mais rápido, enquanto trabalhadores menores poderiam ser mais adequados para remoção de esporos menos acessíveis. Também achamos que os trabalhadores removido com êxito os esporos em cerca de metade das colônias infectadas sub (4 de 9) quando eles foram introduzidos no momento da infecção e, portanto, podem detectar o patógeno precoce (Figura 3c). Em geral, esta aponta para uma série de respostas comportamentais, onde as formigas primeiro tentam parar a infecção Escovopsis removendo esporos (e fazendo antes uma infecção se espalha), em vez de remover partes do jardim do fungo (Figura 3um, b. ). Isso muda com o tempo, se a infecção progride, quando as formigas são mais propensos a remover partes do fungo jardim²⁸. Embora nossos tamanhos de amostra eram demasiado pequenos para ser conclusivo, e não podemos descartar que infecções simultâneas induziram comportamentos capina, nossos dados oferece suporte a esta tendência, com o fungo capina predominantemente, estando presente em fases posteriores da infecção (Figura 3 um). Os níveis geralmente baixos de fungo capina podem sugerir que as formigas usado outras defesas (por exemplo, produtos químicos) para inibir ainda mais o crescimento de Escovopsis, ou que nenhuma das nossas colónias sub experimentais foram também severamente infectadas (fazendo as mais destrutivas defesas desnecessárias).

Nossos resultados sugerem que Self aliciamento com fluido fecal é característica das formigas ao entrar no jardim de fungo e usado como uma medida profilática, ao invés de estar associada a uma infecção. Observações similares foram vistas em fêmeas de fundadora que preparar-se e transferir fecais gotículas com sua boca para suas pernas, ao entrar no ninho ou manusear a lavoura²⁷. Uma infecção deve em teoria aumentar a atividade dos trabalhadores na borda do jardim de fungo, se o material infectado removido é realizado e solto em pilhas de resíduos. Daí, aliciamento de fluido fecal também indiretamente pode aumentar durante a infecção para minimizar a doença se espalhou. Esperamos que o padrão oposto para infecções graves, com movimento reduzido na borda do jardim fungo, como trabalhadores ou abandonam o fungo ou adotam medidas extremas como defesa química.

Enquanto fluidos fecais poderiam servir como um profilático importante químicos para um indivíduo, allogrooming é usado pelos companheiros de ninho para os outros trabalhadores se detectam partículas estranhas ou micróbios. Observou a diferença substancial entre a frequência (tabela 1), de aliciamento de fluido fecal (n = 304) e de allogrooming (n = 48) pode indicar uma diferença na deteção do patógeno. As formigas não são capazes de detectar facilmente patógenos em si mesmos com suas antenas; por outro lado, allogrooming é feito pelos companheiros de ninho, que podem inspecionar todo o corpo de uma formiga e só escolher ao noivo, se necessário. Desde Escovopsis é um parasita do jardim de fungo, em vez das formigas, isso também pode explicar a baixa quantidade de allogrooming.

Raramente observamos glândula metapleural aliciamento e somente em fases posteriores da infecção. Espécie de fungo-crescentes formigas com abundante Pseudonocardia bacteriana capa noivo glândulas metapleural menor que espécies com menos ou não cobrir²⁵^,⁴⁷. Como echinatior a. tem uma abundância do simbionte⁴⁷, isto pode explicar a glândula baixa frequência de aliciamento. A secreção da glândula metapleural também é cara para produzir³⁰e pode ser armazenada dentro do bolso de infrabuccal por longos períodos de tempo, significa que a necessidade de aliciamento da glândula metapleural pode ser pouco frequente. Durante metapleural glândula aliciamento, as formigas, simultaneamente, alternar as pernas e lambem a perna que só tinha preparado a glândula; os esporos, assim, são transferidos para o bolso de infrabuccal, onde secreções das glândulas são críticas para inibir Escovopsis‘ potencial de germinação subsequente²⁵. Trabalhadores menores são mais abundantes dentro do ninho e tem maior metapleural glândulas por unidade corpo massa³⁰, sugerindo que eles são responsáveis pela maioria das secreções glândula metapleural. Isso também explicaria por que, em nosso estudo, a frequência a mais elevada de fungo aliciamento foi entre trabalhadores menores.

Esperávamos observar o comportamento (s) indicando ativo uso dos antibióticos do simbionte bacteriano Pseudonocardia, comumente observado na cutícula dos trabalhadores Acromyrmex e conhecida por desempenhar um papel na defesa contra Escovopsis ³⁶ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰. a explicação mais provável para não observar tal comportamento, é que a aplicação destes antibióticos pode ser incorporada em outros comportamentos, tais como auto aliciamento seguido por fungo aliciamento e/ou remoção de ervas daninhas, que pode torná-lo difícil de observar como uma comportamento distinto.

Observamos o comportamento incomum de regurgitar as gotas líquidas para o jardim de fungo. Regurgitação de alimentos para nestmates foi descrita anteriormente no²². formigas cortadeiras. Na nossa experiência, as gotas diferiam em cor de transparente ao marrom escuro, sugerindo que eles podem ser uma fonte de alimento para outras formigas e/ou fornecer água. Observamos apenas duas ocasiões onde outras formigas beberam as gotas, então não podemos determinar se as gotas beneficiam outras formigas ou servem para Re-hidratar o fungo quando a umidade é baixa. A maioria das observações deste comportamento eram durante infecções Escovopsis , o que podem implicar um papel defensivo, como escorva imune por regurgitação de peptídeos antimicrobianos¹⁶^,⁴⁸. Nós não podemos conclusões firme nisto desde que esse comportamento era raro, mas seria uma interessante linha de investigar mais profundamente, por exemplo, determinando se as gotas tem propriedades antimicrobianas.

Dado que estudos observacionais dos complexos comportamentos defensivos de formigas do folha-cortador, incluindo qualquer comparação com e sem infecção jardim de fungo, seria extremamente difícil fazer no campo, os dados experimentais podem fornecer insights valiosos sobre esses comportamentos sob condições mais controladas. Enquanto as observações feitas sob condições de laboratório podem diferir dos comportamentos encontrados em condições naturais, ferramentas como o nosso catálogo de comportamentos defensivos chaves precisam ser desenvolvido, para melhorar os dois experimental e campo de estudos no futuro. A abordagem experimental pode, no entanto, parcialmente explicar porque alguns comportamentos eram extremamente raros (por exemplo, allogrooming, aliciamento de glândula metapleural) em nossa demonstração de usar essas definições comportamentais. Estudos futuros, portanto, podem considerar as limitações desta configuração experimental, para encontrar maneiras de fazer observações mais naturais. Fatores adicionais também poderiam ser integrados no protocolo atual, tais como a distinção entre portadores de Actinobacteria trabalhadores (mais jovens) e os trabalhadores mais velhos com cobertura menos abundante, que podem responder diferentemente à ameaça de uma Escovopsis infecção. Existem trade-offs entre fazendo observações mais exato (por exemplo marcando focais indivíduos), ou tendo maior colônia sub tamanho (maior número de trabalhadores) e a quantidade de tempo ou número de colônias sub ou indivíduos que pode ser filmado em um determinado ponto no tempo. No entanto, enquanto o set-up poderia ser estendido para maiores estudos comportamentais com foco em abordar um objetivo comportamental, neste caso enfocamos com sucesso, apresentando um método para a gravação e definir comportamentos defensivos específicos.

Nós documentamos comportamentos que contribuem para a defesa em formigas cortadeiras, e mais significativamente, têm sistematicamente identificado, descrito e capturado comportamentos defensivos no filme. Nossos resultados representativos reforçam outras pesquisas neste campo, sugerindo por que é difícil para um patógeno infectar com êxito colónias de formigas fungo-agricultura, quando enfrentar um extenso conjunto de comportamentos defensivos e associado a aplicação de antimicrobianos compostos. Nosso principal objetivo era fornecer uma nova ferramenta para futuros trabalhos neste campo, e esperamos que o catálogo comportamental será valioso para obtenção de consenso e definições simplificadas, observações e interpretações de comportamentos, para servir como um importante recurso para futuras pesquisas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a linha Vej Ugelvig e Kirsten Sheehy discussões úteis sobre aliciamento mecanismos dos limpadores de antena e filmar o set-up. Michael Poulsen é suportado por um Villum Kann Rasmussen Young Investigator Fellowship (VKR10101) and Innocent de Tabitha por um Europeu individuais Marie Curie fellowship (IEF conceder 627949). Também gostaríamos de agradecer o Smithsonian Tropical Research Institute para a utilização das instalações e apoio logístico no Panamá e a Autoridad Nacional del Ambiente para permissão para coletar e exportar as formigas para a Dinamarca.

Materials

Plastic boxes	N/A	N/A	Transparent. Length: 3.15 in (8 cm), width: 2.17 in (5.5 cm), depth: 1.77 in (4.5 cm)
Petri dishes	Sarstedt	82.1472	3.62×0.63 in (9.2×1.6 cm)
Inoculation loops	Labsolute	7696431	Disposable 1uL. Length: 7.67 in (19.5 cm)
Cameras	DBPower	NTC50HD_8.5mm	USB Endoscope Camera
Holders for the cameras	N/A	N/A	Old beaker clamp stand.
Laptop	HP	N/A	Generic laptop for saving recordings.
Program used on the laptop	Windows Movie maker	N/A
Forceps	Vermandel	50.054	Soft
Potato dextrose broth	Sigma-Aldrich	P6685-1KG	24 g/L

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Nilsson-Møller, S., Poulsen, M., Innocent, T. M. A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants. J. Vis. Exp. (140), e58420, doi:10.3791/58420 (2018).

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