A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants

Stephen Nilsson-M&#248;ller; Michael Poulsen; Tabitha M. Innocent

doi:10.3791/58420

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Behavior

病原体の防御行動を研究するための視覚的なガイドの剪葉アリの攻撃します。

Published: October 12, 2018

doi:

10.3791/58420

Stephen Nilsson-Møller¹, Michael Poulsen¹, Tabitha M. Innocent¹

¹Centre for Social Evolution, Section for Ecology and Evolution, Department of Biology,University of Copenhagen

Summary

個々のクリップおよび実験感染シナリオに示す付属の定義を剪葉アリの疾患防御の動作を視覚的なガイドを提案します。私たちの主な目的は他の研究者の主要な防御的な動作を認識してこの分野での今後の研究の一般的な理解を提供します。

Abstract

複雑な生活、高度な協力の進化の歴史と葉切断の蟻の疾患防御は盛んに。数多くの研究は、病の防衛や化学物質や抗菌剤の関連付けの使用との接続動作を説明しているが共通の視覚参照は行っていません。本研究の主な目的は、疾患防御、予防と直接感染コロニーの拮抗薬を対象に関与する動作の短いクリップを記録するためでした。葉さしの蟻種Acromyrmex echinatiorのサブのコロニーとアリの fungal 穀物に最も重要な既知の病原性の脅威、感染実験を使いましたので (Leucoagaricus gongylophorus)、 、専門Escovopsis属の病原性の真菌。撮影し、感染症の初期より高度な段階で感染し、感染していないコロニーを比較します。治療と可能性が高い病原体の攻撃行動に対して変化の働きアリは、異なるカースト間および脅威の初期と後期の検出を示す主要な防御的な動作を定量化しました。主な個別的な防衛行動の定義を伴う行動のクリップのライブラリを行ったこれらの録音に基づいています。このようなガイドが認識し、これらの行動を研究するこの分野で働く研究所員共通フレームの参照を提供でき、また最終的に役割を理解を支援するさまざまな研究を比較するためのより大きな範囲を提供と見込んでください。これらの動作は、病の防衛で遊ぶ。

Introduction

葉切断の蟻高度な社会性昆虫は、地球上最も複雑な植民地の一部を形成します。真菌成長の蟻 (Attini 族) の派生分岐している 2 つの属Acromyrmexとアタ¹で構成されます。彼らを養う fungal 穀物種Leucoagaricus gongylophorus (担子菌類: ハラタケ目)、彼らは、主要な食糧ソース²^,³に依存します。アリがその成長のための新鮮な葉材料でこの菌を供給し、菌が見返り栄養豊富な腫れ菌糸のヒント (gongylidia) アリと彼らのひなによって消費されるを生成します。植民地が地下に構築されて、外部庭園⁴^、⁵、fungal 穀物は維持され、ant 農家⁶^,病原体潜在的な⁷^,^{8 からの作物モノカルチャーを保護します。} ^,⁹^,¹⁰^、¹¹^,¹²。植民地は異なるサイズ (カースト) の労働者と年齢¹³^,¹⁴^,¹⁵、病原体からアリと作物の防衛にひろがる間分業します。

葉さしアリ・コロニーが病気に脆弱性が存在する必要があります私たちがあります。グループリビングは、頻繁に相互作用による関連労働者と、したがって、簡単にトランスミッション¹⁶の間の病気の広がりを促進する予定です。アリは、 Metarhizium種、 Beauveria 材⁶などの病原真菌寄生虫に敏感であります。これらの寄生虫はジェネラリストで、巣⁷^、⁸に近い土壌に多い。単作⁴^,として菌作物の農業⁵では、また病¹⁷^,¹⁸を受ける可能性が高い。(コウジカビニジェール、トリコデルマの種³を含む) ジェネラリスト真菌寄生虫によって感染することがしかし、最も重要な脅威はEscovopsis属の専門家 necrotrophic 菌 (子嚢菌門: ボタンタケ目)¹¹。真菌類溶解酵素の分泌やその他の化合物、 Escovopsisは殺すし、菌作物から¹²アリの植民地¹¹^,¹⁹の潜在的に致命的な結果と栄養素を取得します。

病気の脅威に対処するため、アリ個人と植民地の両方のレベル、合成生物学的制御、感染症に対して、予防的に、とき必要な行動する行動と化学防御で顕著な防御があります。総称して、これらの防御を防ぐまたは感染症病原体ジェネラリストとEscovopsisなどの専門家の両方からの影響を軽減します。広く環境²⁰巣に入ると巣内感染の広がりを制限することから寄生虫を防ぐことで寄生虫の収縮を避けることを含します。防衛の最初の行は、腺分泌物³^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,からの化学物質²⁷菌ガーデンと自己と allogrooming の両方を運ぶアリの設立前にそれらを舐めている労働者からの植物基板を消毒します。巣に入ると特に、自分自身をグルーミング、労働者彼らのボディの²⁷にまた糞便アリオンの酸液あります。これらの予防的防御が明らかに重要な病原性の脅威⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^、¹¹^{、感染を避けるために} ¹²。

アリが真菌胞子²⁵^,²⁸_.を削除するクリーンアップを使用して初期防御は失敗し、 Escovopsisなどの病原体が巣と菌の庭を入力に成功した場合、早い段階で感染症が検出された場合、アリは metapleural 腺からの分泌物を適用、転送胞子 infrabuccal ポケット (口腔)、彼らは metapleural と口唇腺分泌物²⁶を含む化学カクテルと混合されています。Γ – ケト – カルボン酸を含むこれらの腺を 20 以上の知られている化合物がある- と indoleactic 酸³。これらは積極的に応用で²⁵、抗生物質、菌、殺菌のプロパティ²⁹、³⁰ Escovopsis胞子の発芽を抑えることができます。Infrabuccal ポケットに格納されている胞子が後で植民地³¹^,³²外追放されます。この菌の早期検出、次の手入れのほとんどはマイナー労働者²⁸^,³³によって行われます。ただし、病原体検出を避けるために管理、菌庭園内に広がる場合は、両方はマイナーで、主要な労働者²⁸菌の感染部分の雑草、巣³¹外この除去される材料を堆積します。また、 Acromyrmex共生アクチノバクテリア³⁴^,³⁵^,³⁶–によって生成される抗生物質の形で生物学的コントロールを使用して、葉さし属の種の維持主に若い主要な労働者³⁴^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰– Escovopsisの菌糸の成長を妨げる化合物を生成する ant キューティクル³⁷³⁴^,³⁸^,⁴¹。この抗生物質生産可能性がありますEscovopsisによって損なわれる順番-感染症¹⁹の間化合物を生成します。

図 1: Ant 形態。プロトコルに記載されている形態学的構造を示すアリの図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

葉さしアリ防御はこうして病気⁴²からの非常に効率的な保護とこれらのアリをまとめて提供行動および化学的メカニズムの統合されたアセンブリを構成します。広範な関心は、これらの防御を理解することが、彼らは広く研究¹⁶^,²⁰^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴をされています。ただし、明確な定義に役立つだろう的な防衛行動の視覚的コンパイルおよびそれらの研究者による体系的な使用のための説明は、私たちの知る限り、利用できません。Ant の振る舞いを記述するための用語が標準化されて比較的したがっては同じ行動の行為が一貫して名前はさまざまな研究に確実性はありません。ここでは、私たちの主な目標は、明快さと関連付けられている定義を伴う予防と守備の個人の行動のビデオ録画のコンパイルによって標準化を提供することによってこの問題を解決します。我々は我々が観察され結果を我々はまたここで紹介Acromyrmex echinatiorサブ植民地のEscovopsis感染実験のコンテキストでの動作の定量化の行動の実験中にこれらのクリップを撮影として行動の研究のためのこのコンパイルの使用方法の説明例です。

Protocol

1 Escovopsisの分離。削除と湿った脱脂綿Escovopsis発芽し、sporulates までの数日間、シャーレにアリと菌庭の断片を配置することによってAcromyrmex echinatior研究所植民地からEscovopsis系統を分離します。ジャガイモデキストロース寒天 (PDA、39 g/L) に胞子を転送し、約 2 週間 23 ° C でインキュベートします。注: 1 つのひずみは、現在の研究で使用されました。滅菌針を使用して、これらの最初の版から成熟した胞子を選択します。針の先端をカバーする十分な胞子を選択します。無菌条件下で新しい板に胞子を接種し、, で〜 23 ° C、約 2 週間。菌糸をプレート全体を解説し、成熟した茶色の胞子に成長して、1.3 のステップが、今度新しい PDA プレートから胞子を繰り返します。それぞれの株のEscovopsisのきれいな株になるまでのプロセスを取得 (目に見える汚染が成長したり、プレート表面の下) を繰り返します。 2. 実験の設定 3 A. echinatiorコロニーを使用します。注: ここで Ae160b、Ae322、Ae263 のコロニーを使用されました。各植民地から 12 サブコロニーを作る。0 h 後の観察にサブ植民地 6 と 72 時間後の観察にサブ 6 のコロニーを作る。これにより合計で 36 サブコロニー;コントロールとして各 ‘親’ 植民地および「Escovopsis治療」として残りの半分からサブのコロニーの半分をマークします。注: 中親コロニー女王の存在影響者の行動、(これが保証できない)、我々は期待、女王レス副コロニーが実験を実行する時間の短い期間のための queenright のコロニーとして動作する可能性が高い。各サブのコロニーの長さの正方形のボックスを使用して、: 〜 3.15 インチ (8 cm)、幅: 〜 2.17 (5.5 cm) で、深さ ~ 1.77 インチ (4.5 cm)。注: 重要なポイント撮影や動作の認識が可能である飼料し、廃棄物をダンプに菌フラグメント外が十分に小さいボックスをする同時に蟻のため十分なスペースを提供することです。各サブのコロニーの元植民地、キイチゴの葉のカップルから菌ガーデン (L. gongylophorus) の中央部のティースプーンサイズ (約 2.2 cm3と 1.2 g) 作品を追加し、水に浸した脱脂綿の作品。注: 綿ウールは、湿度を提供します。それは水、びっしょり必要がありますいないと菌庭に触れないでください。サブの植民地Escovopsisで治療、接種ループを使用し、 Escovopsisの胞子によってちょうどカバー開口部を埋めます。胞子があまり集まっていないように、10 から 20 倍菌庭の小さな、ローカライズされた部分をやさしくタッピングによって胞子を接種します。サブの植民地コントロールとして使用、滅菌接種ループと菌の庭にEscovopsisのアプリケーションを模倣します。注: 本研究ではこれはないが滅菌粉末 (のようなグラファイトやタルカムパウダー) の接種は病原体の感染と不活性のエージェントとの間を区別するためにこの段階で実行できます。 72 h 観測、サブのコロニーの半分を残す (制御および感染) アリを追加またはビデオの録画を開始する前にEscovopsisの導入の後の 72 時間。注: はそれにEscovopsis胞子は (未発表の in vitroデータ) を発芽する可能性がアリの不在で 72 h を待っています。また (例えばから菌菌ガーデンに存在) 他の感染症の可能性が大きく、この期間はこのトリートメントは確立された感染症の初期段階を示すことが望ましい。 0 h 観測、ステップ 2.6 とレコーディングの前に約 30 分後に直接 2 つの雛、4 つのマイナーな労働者および 4 つの主要な労働者同時に親のコロニーからそれぞれボックスに追加します。 2 主要な労働者から庭園内、キューティクルのほとんどをカバーアクチノバクテリア光色素を持つ若いを使用します。他の 2 つから暗い顔料とアクチノバクテリア laterocervical プレートをカバーして、庭の外を取る。 72 時間の観察、記録、すなわち、 Escovopsis接種後 71.5 h する前に 2.8 と 30 分で 2.8.1 を繰り返します。注: 実験的サブコロニーは確立された自然Acromyrmexコロニーより大幅に小さいです。これは、動作を正確に記録するために必要です。一方、いくつかの行動の頻度に質的影響この可能性があります、サブの植民地の組成が高く定性的行動の相互作用を反映するように自然な植民地での労働者の混合を反映させるのに選ばれました。 3. ビデオ録画と行動を得点ラップトップ (または同等) に接続されている USB 内視鏡を使用し、十分な光を提供します。各サブの植民地 (0 h または 72 時間後の感染症のいずれかで開始) 4 h のビデオ録画を実行します。 36 サブ植民地を記録した後各サブ植民地のすべての個人の関心のすべての動作の映像とスコア 144 h の合計を確認します。注: 現在の実験例では、我々あった 2 つのサブコロニー (植民地 Ae160b からコントロール) と Ae322 の植民地から治療サブ植民地Escovopsis観測の時間数の合計を減らす以外の菌の感染によるものを除外するには136。現象は、するたびに 1 が発生してそれを記録します。注:動作はできるスコアだけが短期または長期の期間のそれ > 1 としてそれが別の動作によって中断された場合または場合アリは、一定期間受動的。 4. 動作注: 行動の定義は、前研究23,27,28,31,45および個人的な観察からの記述の組み合わせを使用して行われました。認識行動のためプロトコルで使用される重要な形態学的構造を展示詳細図、図 1を参照してください。セルフグルーミングとクリーニングアンテナ(ビデオ 1) アリがセルフグルーミングを開始する脚の動きを停止したかどうかに注意してください。アンテナ、前脚 (図 1) のアンテナクリーナー引っ張られる別の拍車に直面してノッチから成る脛骨足根関節にあるクランプ状の構造サイズ毛櫛で45,ことを確認46。アンテナを洗浄した後、アリが粒子および蜂 (図 1) と潜在的な病原体の取り外し、口器を足を引いて足とアンテナクリーナーをきれいを観察します。注: はセルフグルーミングのアンテナとその後アンテナクリーナー (図 1)、クリーニングも足をきれいに口器を使用で構成できます。アリは、その足を洗浄は、最も頻繁、連続 6 本すべての足をきれいにします。グルーミング (動画 2) 菌お知らせアリ菌庭に固定点での足の動きを停止した場合。アンテナが動かず、パラレル、花茎と索 (図 1) 間の角度は約 45 ° 菌に向かって指摘した、アンテナの先端はほとんど下顎骨 (の先端に近い、お互いを触れているを観察します。図 1)。大文字 (上顎) と下部 (唇) 口器が菌をなめるように蜂 (図 1) の出現、開かれているに注意してください。 Allogrooming (動画 3) 別の ant (受信者) またはその逆に 1 つまたは複数のアリが近づいているときは、この行動を観察します。動作中にアリの動きを停止し、の物理的な接触と密接に一緒に立ちます。グルーミングの ant(s) は受信者の ant のボディの大きい区域をカバーする少し移動があります。 Actor(s) のアンテナは動かずと受信 ant または移動および受信機を軽くタップの特定地点へ向かって指摘できることを確認します。花茎と索 (図 1) 間の角度は約 45 ° の特定のポイントまたはタップで修正するかどうかに応じて。俳優の触角の先端が通常互いと (図 1) の下顎骨の先端近くにあります。大文字 (上顎) と下部 (唇) の口器はレシーバー ant をなめるように蜂 (図 1) の出現で開くことに注意してください。 Metapleural 腺の手入れ (動画 4) 観察アリが metapleural 腺 (図 1) のグルーミングを開始する動きを停止したとき。アリが metapleural 腺 (たとえば、右の前部の足) の開港 (道) をこする前脚背中の片側に傾いていることに注意してください。注: 他の前脚は同時に (この例では左の前脚) バルセロナ (図 1) で舐めた。アリはスイッチの足と反対の足で同じ動きを繰り返すことと反対側に傾いていることを確認してください。アリは、metapleural 腺、その後常に足 (図 1) を切り替える蜂に前脚を移動し続けます。注: この例では、アリは今左の前脚に渡す metapleural 腺および蜂 (図 1) に右の前部の足。Metapleural 腺 (図 1) グルーミング後アリはしばしば自己手入れ (手順 4.1) を開始します。胞子除草 (動画 5) アリ菌庭に固定点での足の動きを停止したときは、この現象を確認します。アンテナが動かず、パラレル、花茎と索間の角度は約 45 °、菌に向かって指摘した、アンテナの先端は、お互いと下顎骨 (図 1) の先端にほとんど触れているを確認します。アリがを引いてその下顎骨表示Escovopsis胞子をつかむ fungal 穀物からそれらをデタッチし (図 1) を開くことを確認します。アンテナは向きにゆっくり動いている間、アリは巣から胞子のクラスターを運ぶ。アンテナは、アンテナのクリーナー (図 1;ビデオ 1参照) を胞子のクラスターを押しながら削除があります。アリ廃棄物の山に胞子を低下します。注: 廃棄物の山の周りの活動の記録現在の実験では行わなかったが、現在のプロトコルの適切な拡張子になります。菌除草 (動画 6) アリは、菌の固定ポイントでの足の動きを停止したときは、この現象を確認します。アンテナ緩くアリが若干カビ部分をタップしながら削除しよう菌部に向かって指摘しています。指定された領域をデタッチまたは菌部分 (図 1)、下顎骨の部分をつかむアリが真菌の作物のいずれかのカットに、下顎骨を使用することを確認します。菌部分をひっぱったりしながらアリはその足で同時に左右からをロックします。注: 除草行うことができます複数の労働者、未成年者および専攻学生。そう、いくつかのアリは菌切断、他の揺れや動きを引っ張るを実行します。菌の戸の部分は巣の外に運ばれる、廃棄物の山に落ちています。廃棄物の処分の記録は現在の実験では行わなかったが、現在のプロトコルの適切な拡張子になります。 (動画 7) をグルーミング糞便液アリ菌庭に固定点での足の動きを停止したときは、この現象を確認します。アリは、口器に糞便液の液滴を適用する、ガスター (図 1) とお互いに向かって頭を曲げます。アリが下顎骨 (図 1)、一度に 1 つずつをフロントの足を引っ張ることを確認します。その後、アリは前脚の脛骨足根関節にあるアンテナクリーナー (図 1) をアンテナを移動します。液滴逆流 (動画 8) アリは、菌の固定ポイントでの足の動きを停止したときは、この現象を確認します。アンテナが動かず、パラレル、花茎と索間の角度は約 45 °、菌に対する指摘し、アンテナの先端はほとんどお互いと下顎骨 (図 1) の先端を触れます。光の黄色またはその口器からも茶色に透明であることからさまざまな菌に液体の液滴をアリに逆流を確認します。

Representative Results

本研究の主な目的は、葉さしアリ、将来の研究のための参照として使用するカタログを生成する疾患防御に関連する動作を説明する短いクリップの作成だった。さらに、研究は、これらの行動は行動学、ここに要約の代表的な結果で、このカタログを使用する方法を示す定量化された実験装置の例を使用します。 Sub-colonies は初期段階 (0 h) で後半ステージ (72 h) 感染症の観察のためにセットアップされました。結果のプレゼンテーションを 0 h 時点に着目し、, より少ない重点を置くので 72 時間後Escovopsis以外の真菌による重い感染による 2 つのサブの植民地 (植民地 Ae160b の 1 つのコントロール) と Ae322 のコロニーの 1 つの治療が除外されました。72 時間後に観察された動作です。後サブのすべてのコロニーを撮影、守備の動作を得点感染とマイナーで、主要な労働者によって使用されたさまざまな方法を含む、コンテキストの後時間に関連付けられている行動パターンに違いがみられました。対照的に、セルフグルーミングで行われたすべての時間制御で感染したサブコロニー。アリが求めて、およびEscovopsisの菌糸や胞子を削除しようにも一般的でした。普遍的に観察し、すべての状況で頻繁にこの現象になったので、それを定量化私たちしなかった。サブ植民地 (表 1) あたりのマイナーで、主要な労働者のプロトコルと現在の計算された合計と平均周波数で説明した他のすべての動作を記録しました。コントロールでは、マイナーな労働者 (図 2a)、主要な労働者以上の園芸作物の手入れし、菌の庭で過ごす時間が増えたことを逸話的に観察がわかった。Escovopsisに感染している植民地で増加菌グルーミング制御のコロニーを基準にして全体の傾向にあったが、これは認められなかった (F1, 23 = 2.80、p = 0.1077;テーブル2;図 2). 糞便感染手入れで非有意な増加があった (F1, 23 = 0.60、p = 0.4455;テーブル1) マイナーおよびメジャーの労働者 (図 2b) 間違いはありませんが。長時間のため労働者が、菌を入力したときではなくときに彼らは、または完全に菌からの手入れを糞便を見ました。図 2: イベントをグルーミングの頻度。数の意味 (± 標準誤差 (SE); n = 9) ()菌手入れをすることおよび(b)糞便流体の接種後 4 時間以内のイベントをグルーミング、コントロール、 Escovopsis治療のマイナーおよびメジャー労働者を比較します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。いくつかの挙動は非常にまれであった。我々はのみ metapleural 腺の手入れを 4 回することを観察し、72 h の後に発生したすべてのインスタンスEscovopsis感染症 (表 1) と植民地にコントロール群と 3 回に 1 回。ほとんどにまれに、アリが液滴菌 (表 1) 外菌庭園、数回を繰り返すだろうとわかりました。0 h グループで、これはすべての 3 つのインスタンス制御サブコロニー、2 回感染したコロニー – 主要な労働者によっては動作が実行された後起こった。1 つの機会にマイナーな労働者はかつて主要な労働者はキイチゴの葉、 Escovopsis治療の両方で同じボックスの角に液滴を逆流しました。72 h の植民地で菌液滴逆流だった決して制御のコロニーの観察が感染したコロニーで 7 回が起こった。これらの六つは主要な労働者と菌庭の外滴を追加単一の個人によってこれらの 3 つでした。胞子の草取り (図 3、) と菌除草 (図 3b) の低周波の音の両方いた。菌感染したコロニーとコントロール間除草の頻度に有意差はなかった、感染からの時間とともに増加する除草のための傾向があった (F1, 23= 2.91、p = 0.1014;テーブル2). Escovopsisの胞子除草、時間を大幅に変更していないに焦点を当てた我々の観察が、感染していないコントロール (F1, 23 よりEscovopsisに感染したコロニーのより高い頻度のための傾向があった= 3.27、P = 0.0838;テーブル2). 少ないサブ植民地のEscovopsisに感染していたアリのほぼすべての胞子を削除すると初期段階の感染 (アリの胞子接種 0 h 以降後で導入された) ときの観察期間後残り表示の胞子(4 のうち 9; のサブのコロニーの半分図 3c). 後で段階感染症で (アリが胞子接種 72 時間後導入された)、アリでサブの植民地のいずれかの完全に胞子を除去することはなかった。一緒に取られて、これらの観察は胞子菌感染の経過除草除草からシフトするアリのための傾向を示唆しています。図 3: イベントを除草の頻度。平均周波数 (± 標準誤差 (SE); n = 9) ( Escovopsis胞子) の(a)の胞子の除草と未成年者との治療グループからメジャーを比較する 4 h 観測期間中 (Escovopsisまたは他の菌類) を除草(b)菌の((c))観察期間の終わりに、試験治療グループに表示Escovopsisの胞子を持つサブコロニーの数。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。マイナー労働者 – コントロールマイナー労働者 – 治療主要な労働者 – コントロール主要な労働者 – 治療 0 h 菌のグルーミング 84 (9.333) 131 (14.56) 37 (4.111) 66 (7.333) Allogrooming 6 (0.6667) 14 (1.556) 5 (0.5556) 6 (0.6667) 胞子の除草 0 3 0 5 (0.5556) 菌の除草 0 0 0 0 糞便液グルーミング 46 (5.111) 69 (7.667) 27 (3.000) 48 (5.333) 液滴アプリケーション 0 0 1 (0.1111) 2 (0.2220) Metapleural 腺の手入れ 0 0 0 0 72 h 菌のグルーミング 10 (1.429) 45 (5.000) 24 (3.429) 38 (4.222) Allogrooming 2 (0.2857) 10 (1.111) 1 (0.1110) 4 (0.4440) 胞子の除草 0 0 0 1 (0.1110) 菌の除草 0 1 (0.1110) 0 2 (0.2220) 糞便液グルーミング 19 (2.714) 38 (4.222) 30 (4.286) 30 (3.333) 液滴アプリケーション 0 1 (0.1110) 0 6 (0.6667) Metapleural 腺の手入れ 0 2 (0.2220) 1 (0.1429) 1 (0.1110) テーブル1: 観測の 4 時間動作の数0と72h 後Escovopsis接種。(かっこで個人ごと平均周波数)、による観測の平均合計数コントロールとEscovopsis感染サブコロニーからマイナーで、主要な労働者をそれぞれ比較すること (n = 9)。固定効果の 3 種類のテスト菌のグルーミング Allogrooming 糞便のグルーミング胞子の除草菌の除草効果 Num DF デン DF F 値 Pr > F Num DF デン DF F 値 Pr > F Num DF デン DF F 値 Pr > F Num DF デン DF F 値 Pr > F Num DF デン DF F 値 Pr > F コロニー 2 23 0.77 0.4733 2 23 0.52 0.5989 2 23 0.54 0.5903 2 23 0.51 0.6052 2 23 1.17 0.3272 サブの植民地 (コロニー) 6 23 0.93 0.4892 6 23 0.51 0.7978 6 23 0.63 0.7067 6 23 1.67 0.1742 6 23 1.53 0.2127 治療 1 23 2.8 0.1077 1 23 1.85 0.1875 1 23 0.6 0.4455 1 23 3.27 0.0838 1 23 1 0.3275 時間 1 23 6.53 0.0177 1 23 0.88 0.3574 1 23 0.97 0.3361 1 23 0.53 0.4742 1 23 2.91 0.1014 テーブル2: 混合分散分析の統計結果を統計解析を実行することができる別の行動テスト。固定効果は、植民地、サブの植民地 (コロニーの中で入れ子になっている)、治療と時間をだった。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。ビデオ 1: 自己毛づくろいとアンテナ洗浄します。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。右クリックしてダウンロードします。ビデオ 2: 菌グルーミングします。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。右クリックしてダウンロードします。ビデオ 3: Allogrooming です。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。右クリックしてダウンロードします。ビデオ 4: Metapleural 腺グルーミングします。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。右クリックしてダウンロードします。ビデオ 5: 胞子除草します。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。右クリックしてダウンロードします。ビデオ 6: 菌除草します。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。右クリックしてダウンロードします。ビデオ 7: 糞便液グルーミングします。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。右クリックしてダウンロードします。ビデオ 8: 液滴逆流します。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。右クリックしてダウンロードします。

Discussion

本研究の主な目的は観察し、菌ガーデン感染Escovopsisのための参照クリップを作成するとレコードの特徴的な葉さしアリ防衛行動をより広い科学界に使用します。これらの動作は、排他的ではないことに注意してくださいEscovopsisからの植民地の防衛に他の汚染物質や感染症⁶^,⁷^,⁸^,^{9 に対する防衛のためにも役割を果たす可能性がありますが、} ^,^,¹⁰¹¹^,¹²,⁴²自身アリの防衛のために。私達のプロトコルにより背景が菌の成長の防御より広い研究アリ。これは特に有用である: (i) 若手研究者これらの動作に精通していないため(ii) へのセキュリティで保護された一貫性のある定義と動作の観察(iii) 研究とアリの種の間で比較を容易にする(iv) これらの動作の数がありますのでそう頻繁経験も研究者決して観察したかもしれない。(iv) ための実験室の助けで制御された条件で動作を認識・理解研究の in situ条件が制御するため困難です。

私たちの行動の研究からの結果はその未成年者を示した前作品と一致している労働者菌新郎-重要な感染症が早期に検出された場合-以上主要な労働者²⁵^,²⁸^,³²。ここでは、主要な労働者は、(図 2、) Escovopsis感染後真菌グルーミングの量を増やしました。これは、マイナーな労働者が優勢な菌ゲレンデが、感染を確立された主要な労働者より多くの拡散防止に役立つことを示唆しています。マイナーな労働者に以下のアクセスの胞子を除去に適してなる可能性が大きい主要な労働者はより速く、胞子を削除できます。また、感染症の時に導入された、従って病原体初期 (図 3c) を検出することが、労働者が感染したサブコロニー (9 つのうち 4) の約半分で正常に胞子が削除されたと分かった。全体的にみて、アリが最初に試みる行動応答のシリーズにこのポイントは胞子を除去することによってEscovopsisの感染症を停止 (とこうやって感染広がる)、菌の庭の部分を削除するのではなく (図 3、b。).これはアリが菌ガーデン²⁸の部分を削除する可能性が高い場合、感染症が進行する場合は時間と共に変わります。私たちのデータが真菌感染 (図 3 の後の段階で存在している主に除草にこの傾向をサポート、サンプルサイズが小さすぎて、決定的でなければ、同時感染除草行動を誘発したことを排除できないが、、)。菌の除草の一般的に低レベルが示唆するアリがさらにEscovopsisの成長を阻害する他の防御 (例えば、化学物質) を使用、または我々の実験的サブ植民地のどれもは余りに厳しく (感染しなかったともっと破壊的な防御不要)。

示唆されたこと糞便液自己手入れ菌庭に入るアリの特徴であるし、感染症に関連付けられているのではなく、予防策として使用されます。似たような観測は、パネルシアター女性自分自身をグルーミングし巣に入るとき、自分の足に、口で糞便の液滴を転送で見られている作物²⁷を処理または。感染増やす必要があります理論で菌の庭の端の労働者の活動削除感染材料を実施し、廃棄物の山に落とした場合。したがって、糞便液グルーミング可能性がありますも間接的に増やすこと感染症疾患感染を最小限に抑えるために。我々は労働者が菌を放棄または化学防衛などもっと極端な手段を採用すると菌の庭の端に減らされた動きと、重篤な感染症の逆のパターンを期待しました。

糞便中の水分は、個々の化学重要な予防として役立つことができる中、異物や微生物を検出した場合、allogrooming が他の労働者に巣の仲間によって使用されます。相当な相違を糞便液グルーミングの頻度 (表 1) 間見ました (n = 304) と allogrooming (n = 48) 病原体検出の違いを示す可能性があります。アリは、簡単に彼ら自身の彼らのアンテナと病原体を検出することがないです。一方、allogrooming は、巣の仲間、がアリの全身を検査でき、新郎の必要な場合にのみ選択によって行われます。Escovopsisはアリではなく、菌の庭の寄生虫なのでこれはまた allogrooming の少量を説明するかもしれない。

我々はめったにクリーンアップ、および感染症の後の段階でのみ metapleural 腺を観察しました。真菌の成長の種豊富な導入細菌カバー付きアリ metapleural 腺を新郎は、少ない種またはいいえカバー²⁵^,⁴⁷未満。A. echinatiorが共生⁴⁷の豊かさにあり、これは周波数をグルーミング低腺を説明するかもしれない。Metapleural 腺の分泌は、³⁰日を生成する高価なも、metapleural 腺の手入れをすることの必要性が頻繁にないことを意味時間の長い期間の infrabuccal ポケット内に格納することがあります。グルーミング metapleural 腺、中にアリは同時にスイッチの足と腺の手入れだけ足をなめる胞子、腺分泌物がEscovopsisを阻害するための重要な infrabuccal ポケットにそれにより転送 ‘ 発芽²⁵潜在的な。マイナー労働者巣の中より豊富なユニット本体質量³⁰、あたりの大きな metapleural 腺 metapleural 腺分泌物の大半を担当している示唆しています。これはまた、私たちの研究では菌のグルーミングの最高周波数何故マイナーな労働者を説明できます。

我々は動作アクティブを示す細菌共生導入、一般Acromyrmex労働者のキューティクルの観察し、 Escovopsisに対する防衛の役割を果たすことが知られてからの抗生物質の使用を観察すると予想³⁶^,³⁹^,⁴⁰そのような行動を観察しないため最も可能性の高い説明はこれらの抗生物質のアプリケーションを他の動作に組み込むことができる続くセルフグルーミング菌の手入れや除草、として観察するハードになることなど、。異なる動作です。

Regurgitating 菌庭に液滴の異常な現象が見られました。Nestmates のための食糧の逆流は、葉さしアリ²²以前記載されています。私たちの実験では水滴異なる色が透明からダークブラウン、彼らは他のアリの食料源および水を提供する可能性があることを示唆します。他のアリが、水滴から飲んだ我々は、水滴が他のアリの利益や湿度が低いときに菌を水分補給に役立つかどうかを判断できないので、2 回だけ観察した.Escovopsis感染症は、抗菌ペプチド¹⁶^,⁴⁸の逆流による免疫プライミングなどの防衛の役割を意味するかもしれない間、この現象のほとんどの観測でした。以来、この現象は稀、だったが、それはさらに調査する、たとえば、決定することで液滴は、抗菌特性を持つかどうかの興味深いライン、我々はこの上の確固たる結論を描画できません。

リーフカッターアリの複雑な防衛行動の観測研究を考えると、フィールドの非常に困難になる庭の真菌感染症との比較を含む、実験データは、貴重な洞察を提供できます。下でこれらの行動もっと条件を制御します。実験条件下で観察は、自然条件下で発見した行動から異なる場合があります、キー的な防衛行動の私達のカタログなどのツールを開発、向上に努めることを必要な実験とフィールドは、将来的に研究します。実験的アプローチ、しかし、部分的に説明するかもしれないなぜいくつかの行動は極めてまれだった (例えばallogrooming、metapleural 腺グルーミング) これらの行動の定義を使用しての私たちのデモで。今後の研究は従ってこの実験装置より自然な観察の方法を見つけることの制限を考慮するかもしれない。付加的な要因は、アクチノバクテリアを運ぶ (若い) 労働者と異なる、 Escovopsisの脅威への対応がより少なく豊富なカバーと高齢労働者の区別など、現在のプロトコルに統合されること感染症。(たとえば焦点個人の得点) でより正確な観測を作るまたはサブコロニーサイズ (大きい数の労働者) と時間量またはで撮影することができますサブ植民地や個人の数を持つとの間のトレードオフを指定しました。時点します。それにもかかわらず、セットアップは、行動目標を対処するのに焦点をより大規模な行動研究の拡張が、ここで我々に焦点を当てて正常に記録、特定の防御的な動作を定義するための方法を紹介します。

我々は切葉アリの防衛に寄与する行動を文書化し、大幅に体系的に識別、説明と映画的な防衛行動をキャプチャします。当社の代表的な結果をなぜそれが難しい防衛行動の設定し、抗菌のアプリケーションに関連付けられている大規模な直面している菌類耕作アリ・コロニーを正常に感染する病原体の示唆しているこの分野の他の研究を強化します。化合物。私たちの主な目標はこの分野での今後の作業のための新しいツールを提供する、我々は行動のカタログがコンセンサスと合理化された定義、観察、および重要なリソースとして提供するために、行動の解釈を確保するために貴重な証明することを願って今後の研究。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

アンテナ機のメカニズムをグルーミングと設定を撮影についての有益な議論の行 Vej Ugelvig とキルステン・シーヒーに感謝したいと思います。Villum ラスムッセン Kann ヤングフェロー捜査官 (VKR10101) と、マリーキュリー個々ヨーロッパでタバサ無実マイケルポウルセンはサポートされて (IEF 付与 627949) の交わり。私たちも収集し、デンマークにアリをエクスポートする設備、パナマでは、後方支援の使用のためのスミソニアン熱帯研究所と許可 Autoridad ナシオナル・デル・アンビエンテに感謝したいと思います。

Materials

Plastic boxes	N/A	N/A	Transparent. Length: 3.15 in (8 cm), width: 2.17 in (5.5 cm), depth: 1.77 in (4.5 cm)
Petri dishes	Sarstedt	82.1472	3.62×0.63 in (9.2×1.6 cm)
Inoculation loops	Labsolute	7696431	Disposable 1uL. Length: 7.67 in (19.5 cm)
Cameras	DBPower	NTC50HD_8.5mm	USB Endoscope Camera
Holders for the cameras	N/A	N/A	Old beaker clamp stand.
Laptop	HP	N/A	Generic laptop for saving recordings.
Program used on the laptop	Windows Movie maker	N/A
Forceps	Vermandel	50.054	Soft
Potato dextrose broth	Sigma-Aldrich	P6685-1KG	24 g/L

References

Hölldobler, B., Wilson, E. O. . The ants. , (1990).
Weber, N. A. . Gardening ants, the attines. , (1972).
Bot, A. N. M., Ortius-Lechner, D., Finster, K., Maile, R., Boomsma, J. J. Variable sensitivity of fungi and bacteria to compounds produced by the metapleural glands of leaf-cutting ants. Insectes Sociaux. 49 (4), 363-370 (2002).
Poulsen, M., Boomsma, J. J. Mutualistic fungi control crop diversity in fungus-growing ants. Science. 307 (5710), 741-744 (2005).
Mueller, U. G., Scott, J. J., Ishak, H. D., Cooper, M., Rodrigues, A. Monoculture of Leafcutter Ant Gardens. Plos One. 5 (9), (2010).
Hughes, W. O. H., Thomsen, L., Eilenberg, J., Boomsma, J. J. Diversity of entomopathogenic fungi near leaf-cutting ant nests in a neotropical forest, with particular reference to Metarhizium anisopliae var. anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 85 (1), 46-53 (2004).
Samson, R. A., Evans, H. C., Latgé, J. -. P. . Atlas of entomopathogenic fungi. , (1988).
Shah, P. A., Pell, J. K. Entomopathogenic fungi as biological control agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 413-423 (2003).
Hughes, D. P., Evans, H. C., Hywel-Jones, N., Boomsma, J. J., Armitage, S. A. O. Novel fungal disease in complex leaf-cutting ant societies. Ecological Entomology. 34 (2), 214-220 (2009).
Andersen, S. B., et al. The Life of a Dead Ant: The Expression of an Adaptive Extended Phenotype. American Naturalist. 174 (3), 424-433 (2009).
Currie, C. R., Mueller, U. G., Malloch, D. The agricultural pathology of ant fungus gardens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7998-8002 (1999).
Reynolds, H. T., Currie, C. R. Pathogenicity of Escovopsis weberi: The parasite of the attine ant-microbe symbiosis directly consumes the ant-cultivated fungus. Mycologia. 96 (5), 955-959 (2004).
Camargo, R. S., Forti, L. C., Lopes, J. F. S., Andrade, A. P. P., Ottati, A. L. T. Age polyethism in the leaf-cutting ant Acromyrmex subterraneus brunneus Forel, 1911 (Hym., Formicidae). Journal of Applied Entomology. 131 (2), 139-145 (2007).
Hughes, W. O. H., Sumner, S., Van Borm, S., Boomsma, J. J. Worker caste polymorphism has a genetic basis in Acromyrmex leaf-cutting ants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (16), 9394-9397 (2003).
Wilson, E. O. Caste and Division of Labor in Leaf-Cutter Ants (Hymenoptera, Formicidae, Atta). 2. The Ergonomic Optimization of Leaf Cutting. Behavioral Ecology and Sociobiology. 7 (2), 157-165 (1980).
Schmid-Hempel, P. Parasites and Their Social Hosts. Trends in Parasitology. 33 (6), 453-462 (2017).
Hamilton, W. D., Axelrod, R., Tanese, R. Sexual Reproduction as an Adaptation to Resist Parasites (a Review). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (9), 3566-3573 (1990).
Zhu, Y. Y., et al. Genetic diversity and disease control in rice. Nature. 406 (6797), 718-722 (2000).
Heine, D., et al. Chemical warfare between leafcutter ant symbionts and a co-evolved pathogen. Nature Communications. 9, (2018).
Cremer, S., Pull, C. D., Furst, M. A. Social Immunity: Emergence and Evolution of Colony-Level Disease Protection. Annual Review of Entomology. 63, 105-123 (2018).
Quinlan, R. J., Cherrett, J. M. Role of Substrate Preparation in Symbiosis between Leaf-Cutting Ant Acromyrmex octospinosus (Reich) and Its Food Fungus. Ecological Entomology. 2 (2), 161-170 (1977).
Richard, F. J., Errard, C. Hygienic behavior, liquid-foraging, and trophallaxis in the leaf-cutting ants, Acromyrmex subterraneus and Acromyrmex octospinosus. Journal of Insect Science. 9, (2009).
Reber, A., Purcell, J., Buechel, S. D., Buri, P., Chapuisat, M. The expression and impact of antifungal grooming in ants. Journal of Evolutionary Biology. 24 (5), 954-964 (2011).
Poulsen, M., Bot, A. N. M., Boomsma, J. J. The effect of metapleural gland secretion on the growth of a mutualistic bacterium on the cuticle of leaf-cutting ants. Naturwissenschaften. 90 (9), 406-409 (2003).
Fernandez-Marin, H., Zimmerman, J. K., Rehner, S. A., Wcislo, W. T. Active use of the metapleural glands by ants in controlling fungal infection. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 273 (1594), 1689-1695 (2006).
Fernandez-Marin, H., et al. Functional role of phenylacetic acid from metapleural gland secretions in controlling fungal pathogens in evolutionarily derived leaf-cutting ants. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), (2015).
Fernandez-Marin, H., Zimmermann, J. K., Wcislo, W. T. Nest-founding in Acromyrmexoctospinosus (Hymenoptera, Formicidae, Attini): demography and putative prophylactic behaviors. Insectes Sociaux. 50 (4), 304-308 (2003).
Currie, C. R., Stuart, A. E. Weeding and grooming of pathogens in agriculture by ants. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 268 (1471), 1033-1039 (2001).
Ortius-Lechner, D., Maile, R., Morgan, E. D., Boomsma, J. J. Metaplural gland secretion of the leaf-cutter ant Acromyrmex octospinosus: New compounds and their functional significance. Journal of Chemical Ecology. 26 (7), 1667-1683 (2000).
Poulsen, M., Bot, A. N. M., Nielsen, M. G., Boomsma, J. J. Experimental evidence for the costs and hygienic significance of the antibiotic metapleural gland secretion in leaf-cutting ants. Behavioral Ecology and Sociobiology. 52 (2), 151-157 (2002).
Bot, A. N. M., Currie, C. R., Hart, A. G., Boomsma, J. Waste management in leaf-cutting ants. Ethology Ecology & Evolution. 13 (3), 225-237 (2001).
Little, A. E. F., Murakami, T., Mueller, U. G., Currie, C. R. Defending against parasites: fungus-growing ants combine specialized behaviours and microbial symbionts to protect their fungus gardens. Biology Letters. 2 (1), 12-16 (2006).
Abramowski, D., Currie, C. R., Poulsen, M. Caste specialization in behavioral defenses against fungus garden parasites in Acromyrmex octospinosus leaf-cutting ants. Insectes Sociaux. 58 (1), 65-75 (2011).
Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).
Scheuring, I., Yu, D. W. How to assemble a beneficial microbiome in three easy steps. Ecology Letters. 15 (11), 1300-1307 (2012).
Worsley, S. F., et al. Symbiotic partnerships and their chemical interactions in the leafcutter ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecological News. 27, 59-74 (2018).
Currie, C. R., Poulsen, M., Mendenhall, J., Boomsma, J. J., Billen, J. Coevolved crypts and exocrine glands support mutualistic bacteria in fungus-growing ants. Science. 311 (5757), 81-83 (2006).
Poulsen, M., et al. Variation in Pseudonocardia antibiotic defence helps govern parasite-induced morbidity in Acromyrmex leaf-cutting ants. Environmental Microbiology Reports. 2 (4), 534-540 (2010).
Poulsen, M., Cafaro, M., Boomsma, J. J., Currie, C. R. Specificity of the mutualistic association between actinomycete bacteria and two sympatric species of Acromyrmex leaf-cutting ants. Molecular Ecology. 14 (11), 3597-3604 (2005).
Andersen, S. B., Hansen, L. H., Sapountzis, P., Sorensen, S. J., Boomsma, J. J. Specificity and stability of the Acromyrmex-Pseudonocardia symbiosis. Molecular Ecology. 22 (16), 4307-4321 (2013).
Currie, C. R., Bot, A. N. M., Boomsma, J. J. Experimental evidence of a tripartite mutualism: bacteria protect ant fungus gardens from specialized parasites. Oikos. 101 (1), 91-102 (2003).
Cremer, S., Armitage, S. A. O., Schmid-Hempel, P. Social immunity. Current Biology. 17 (16), R693-R702 (2007).
Schluns, H., Crozier, R. H. Molecular and chemical immune defenses in ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecological News. 12, 237-249 (2009).
Masri, L., Cremer, S. Individual and social immunisation in insects. Trends in Immunology. 35 (10), 471-482 (2014).
Hackmann, A., Delacave, H., Robinson, A., Labonte, D., Federle, W. Functional morphology and efficiency of the antenna cleaner in Camponotus rufifemur ants. Royal Society Open Science. 2 (7), (2015).
. How ants use ‘combs’ and ‘brushes’ to keep their antennae clean Available from: https://www.youtube.com/watch?time_continue=65&v=AB4HoeloqZw (2015)
Fernandez-Marin, H., Zimmerman, J. K., Nash, D. R., Boomsma, J. J., Wcislo, W. T. Reduced biological control and enhanced chemical pest management in the evolution of fungus farming in ants. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 276 (1665), 2263-2269 (2009).
Konrad, M., et al. Social Transfer of Pathogenic Fungus Promotes Active Immunisation in Ant Colonies. Plos Biology. 10 (4), (2012).

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Nilsson-Møller, S., Poulsen, M., Innocent, T. M. A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants. J. Vis. Exp. (140), e58420, doi:10.3791/58420 (2018).

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