A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants

Stephen Nilsson-M&#248;ller; Michael Poulsen; Tabitha M. Innocent

doi:10.3791/58420

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Behavior

Una guida visiva per studiare le difese del comportamento patogeno attacca in formiche tagliafoglie

Published: October 12, 2018

doi:

10.3791/58420

Stephen Nilsson-Møller¹, Michael Poulsen¹, Tabitha M. Innocent¹

¹Centre for Social Evolution, Section for Ecology and Evolution, Department of Biology,University of Copenhagen

Summary

Vi presentiamo una guida visiva per comportamenti di difesa di malattia in formiche tagliafoglie, con singole clip e definizioni di accompagnamento, illustrate in uno scenario di infezione sperimentale. Il nostro obiettivo principale è di aiutare altri ricercatori a riconoscere comportamenti difensivi chiavi e di fornire una comprensione comune per la ricerca futura in questo campo.

Abstract

Lo stile di vita complessa, storia evolutiva di cooperazione avanzata e le difese di malattia di formiche tagliafoglie sono ben studiati. Anche se numerosi studi hanno descritto i comportamenti connessi con la difesa di malattia e l’uso associato di prodotti chimici e gli antimicrobici, non compiuto riferimento visivo comune. Lo scopo principale di questo studio era di registrare brevi clip dei comportamenti coinvolti nella difesa di malattia sia direttamente che come profilassi mirata verso un antagonista della Colonia dopo l’infezione. Per farlo abbiamo usato un esperimento di infezione, con Sub-colonie della specie di formiche tagliafoglie Acromyrmex echinatiore la minaccia di patogena nota più significativa per colture fungine delle formiche (Leucoagaricus gongylophorus), un specializzato fungo patogeno del genere Escovopsis. Abbiamo girato e rispetto colonie infetti e non infette, alle fasi sia precoce e più avanzati dell’infezione. Abbiamo quantificato i comportamenti difensivi chiavi attraverso trattamenti e mostrano che la risposta comportamentale all’attacco patogeno probabile varia tra le diverse caste di formiche operaie e tra rilevamento precoce e tardivo di una minaccia. Basato su queste registrazioni che abbiamo fatto una raccolta di clip comportamentale, accompagnato da definizioni dei principali comportamenti difensivi individuali. Prevediamo che una tale guida può fornire un quadro comune di riferimento per altri ricercatori che lavorano in questo campo riconoscere e studiare questi comportamenti e forniscono anche una maggiore possibilità di confrontare i diversi studi per in definitiva aiutare a comprendere meglio il ruolo questi comportamenti giocare in difesa di malattia.

Introduction

Formiche tagliafoglie sono avanzate gli insetti sociali, formando alcune delle colonie più complesse sulla terra. Sono un ramo derivato delle formiche crescita fungo (tribù Attini) che consiste di due generi Acromyrmex e Atta¹. Coltivano le specie di colture fungine Leucoagaricus gongylophorus (Basidiomycota: Agaricales), che si basano su come loro fonte di cibo principale²^,³. Le formiche forniscono questo fungo con materiale fresco foglia per la sua crescita e il fungo in cambio produce nutriente gonfiati ifale suggerimenti (gongylidia) che vengono consumati da formiche e loro covata. Colonie sono costruiti nel sottosuolo, le colture fungine sono mantenute in giardini esterni⁴^,⁵, e gli agricoltori di formica proteggono loro monocoltura raccolto da potenziali agenti patogeni⁶^,⁷^,⁸ ^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Colonie dividono il lavoro tra i lavoratori di diverse dimensioni (casta) ed età¹³^,¹⁴^,¹⁵, che si estende alla difesa di formiche e raccolto da agenti patogeni.

Ci si potrebbe aspettare che le colonie di formiche tagliafoglie dovrebbero essere vulnerabili alla malattia. Gruppo vivente dovrebbe facilitare la diffusione di malattie tra gli operai relativi a causa di interazioni frequenti e, quindi, più facile trasmissione¹⁶. Le formiche sono suscettibili di parassiti fungini entomopatogeni, come specie di Metarhizium e Beauveria bassiana⁶. Questi parassiti sono generici e sono spesso presenti nel terreno vicino il nidi⁷^,⁸. Agricoltura del fungo raccolto come una monocoltura⁴^,⁵ rende probabile anche suscettibili alla malattia¹⁷^,¹⁸. Esso può essere infettato da parassiti fungini generalista (tra cui Aspergillus niger e Trichoderma specie³); Tuttavia, la minaccia più significativa è un fungo parassita di specialista del genere Escovopsis (Ascomycota: Hypocreales)¹¹. Attraverso la secrezione di enzimi mycolytic e altri composti, Escovopsis uccide e ottiene i nutrienti dal fungo raccolto¹², con conseguenze potenzialmente fatali per la formica colonie¹¹^,¹⁹.

Per combattere le minacce di malattia, le formiche hanno difese notevole a livello sia individuali che di Colonia, che unisce controllo biologico, comportamentale e chimiche difese ad agire come profilassi e, quando necessario, in risposta all’infezione. Collettivamente, queste difese prevenire o riducono l’impatto delle infezioni da agenti patogeni generalisti e specialisti quali Escovopsis. In generale essi coinvolgono evitando la contrazione dei parassiti nell’ambiente²⁰, prevenire i parassiti di entrare il nido e limitando la diffusione dell’infezione all’interno di nidi. Le prime linee di difesa includono prodotti chimici da secrezioni ghiandolari³^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^, ²⁷ per disinfettare i substrati vegetali, attraverso i lavoratori li leccare prima dell’incorporazione nel giardino di fungo e formiche che trasportano sia self – e allogrooming. Governare se stessi, soprattutto entrando il nido, lavoratori potrebbero anche applicare acide secrezioni fecale al loro corpo²⁷. Queste difese profilattiche sono in modo dimostrabile importante per evitare infezioni da patogeni minacce⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^, ¹².

Se le difese iniziali non riuscire e un agente patogeno come Escovopsis riesce a entrare il nido e il giardino di fungo, e se l’infezione viene rilevato in una fase iniziale, le formiche utilizzano fungo toelettatura per rimuovere le spore²⁵^,²⁸_. Le formiche possono applicare le secrezioni dalle ghiandole metapleural o trasferire le spore per la tasca di infrabuccal (una cavità orale), dove si sono mescolati con un cocktail chimico contenente metapleural e labial della ghiandola secrezioni²⁶. Non ci sono più di 20 composti conosciuti in queste ghiandole, tra cui γ – cheto-, carbossilico- e indoleactic acidi³. Questi sono attivamente applicata²⁵, hanno proprietà antibiotiche, fungistatico e fungicida²⁹e può inibire Escovopsis spora germinazione³⁰. Spore memorizzate nella tasca infrabuccal più tardi vengono espulsi all’esterno la Colonia³¹^,³². Parte di questo fungo toelettatura seguito rilevazione precoce è svolto dai lavoratori minori²⁸^,³³. Tuttavia, se un agente patogeno riesce a evitare il rilevamento e si diffonde all’interno del giardino del fungo, sia maggiori e minori lavoratori erbaccia parti infette del fungo²⁸, e questo materiale rimosso viene depositato di fuori del nido³¹. Inoltre, le specie del genere di foglio-taglio Acromyrmex utilizzare controllo biologico in forma di antibiotici prodotti da simbiotico Actinobacteria³⁴^,³⁵^,³⁶— mantenuti su la formica cuticola³⁷prevalentemente giovani lavoratori principali³⁴^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰— per produrre composti che impediscono la crescita micelia del Escovopsis ³⁴ ^, ³⁸ ^, ⁴¹. questa produzione antibiotica a sua volta può essere compromessa da Escovopsis-prodotti composti durante un’ infezione¹⁹.

Figura 1: caratteristiche morfologiche Ant. Un disegno schematico di una formica mostrando le strutture morfologiche menzionate nel protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le difese di formica tagliafoglie costituiscono quindi un gruppo integrato di meccanismi comportamentali e chimici che forniscono collettivamente queste formiche con una protezione molto efficace da malattia⁴². La comprensione di queste difese è di vasto interesse, e sono stati ampiamente studiati¹⁶^,²⁰^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴. Tuttavia, una compilazione visual dei comportamenti difensivi che aiuterebbe inequivocabile definizione e descrizione del loro uso sistematico dai ricercatori è, a nostra conoscenza, non è disponibile. Anche se la terminologia utilizzata per descrivere il comportamento della formica è relativamente standardizzata, non esiste quindi alcuna certezza che gli stessi atti comportamentali sono denominati in modo coerente negli studi differenti. Qui, il nostro obiettivo principale è quello di rimediare a questo, fornendo chiarezza e standardizzazione attraverso una raccolta di registrazioni video di singoli comportamenti profilattici e difensivi, accompagnato da definizioni associate. Abbiamo girato queste clip durante un esperimento comportamentale, in cui abbiamo osservato e quantificato i comportamenti nel contesto di infezioni sperimentali Escovopsis di Acromyrmex echinatior Sub-colonie, i cui risultati vi presentiamo anche qui come un esempio chiarificatore di come questa compilazione può essere utilizzata per studi comportamentali.

Protocol

1. isolamento Escovopsis Isolare i ceppi Escovopsis da colonie di laboratorio Acromyrmex echinatior , inserendo frammenti giardino di fungo, con formiche rimosse, su una piastra Petri con batuffolo di cotone umido per diversi giorni fino a quando Escovopsis germina e sporulates. Trasferimento di spore per piastre di patata destrosio agar (PDA, 39 g/L) e incubare a ca. 23° C per circa due settimane.Nota: Uno sforzo è stato utilizzato nello studio corrente. Utilizzare un ago sterile per scegliere spore mature da questi primi piatti. Raccogliere abbastanza spore per coprire la punta dell’ago. Inoculare le spore su nuove piastre in condizioni sterili e incubare a ~ 23 ° C per circa due settimane. Quando IFE hanno coperto l’intera piastra e cresciuta fino a diventare spore mature marrone, ripetere il passaggio 1.3 ma questa volta con spore dalla nuova piastra di PDA. Ripetere il processo fino a quando un magazzino pulito di Escovopsis per ogni ceppo è acquisito (nessun impurità visibili crescendo sulla o sotto la superficie della piastra). 2. sperimentale Utilizzare tre colonie di a. echinatior .Nota: Qui le colonie Ae160b, Ae322 e Ae263 sono state usate. Da ogni Colonia, fare 12 Sub-colonie. Fare sei Sub-colonie per osservazione dopo 0 h e sei Sub-colonie per osservazione dopo 72 h. Questo dà un totale di 36 Sub-colonie; contrassegnare la metà delle Sub-colonie da ogni colonia di ‘padre’ come controllo e l’altra metà come’Escovopsis trattamento’.Nota: Mentre nelle colonie di padre la presenza di una regina colpisce il comportamento del lavoratore, ci aspettiamo che (anche se questo non può essere garantito), che Sub-colonie regina-di meno sono propensi a comportarsi come colonie di queenright per il breve periodo di tempo in cui viene eseguito l’esperimento. Per ogni sub-Colonia, utilizzare una scatola quadrata di lunghezza: ~ 3,15 pollici (8 cm), Larghezza: ~ 2.17 in (5,5 cm) e profondità ~ 1.77 in (4,5 cm).Nota: Il punto importante è di fornire abbastanza spazio per le formiche fuori il frammento di fungo per foraggio e la discarica di rifiuti, ma allo stesso tempo per rendere la casella abbastanza piccolo che le riprese e il comportamento di riconoscimento è fattibile. Per ogni sub-Colonia, aggiungere un pezzo di cucchiaino da tè di dimensioni (circa 2,2 cm3 e 1,2 g) della parte centrale del giardino fungo (L. gongylophorus) dalla colonia originale, un paio di foglie di rovo, e un pezzo di cotone idrofilo imbevuto di acqua.Nota: La lana di cotone fornisce umidità. Esso non deve essere grondante di acqua e non deve toccare il giardino di fungo. Per le sub-colonie trattate con Escovopsis, utilizzare un ciclo di inoculazione e riempire l’apertura così è appena coperto da Escovopsis spore. Inoculare le spore picchiettando delicatamente una parte piccola, localizzata del fungo giardino dieci a venti volte, così che le spore non sono troppo in cluster. Per le sub-colonie utilizzati come controlli, imitare l’applicazione di Escovopsis per il giardino di fungo con un ciclo di inoculazione sterile.Nota: Anche se questo non è stato fatto nel presente esperimento, l’inoculazione di una polvere sterile (come grafite o talco) può essere fatto in questa fase di distinguere tra un’infezione con un agente patogeno e un agente inerte. Per osservazioni di 72h, lasciare la metà delle Sub-colonie (controlla e infettati) per 72 h dopo introduzione di Escovopsis prima di aggiungere le formiche o avviare la registrazione video.Nota: In attesa di 72 h in assenza di formiche rende probabile che Escovopsis spore germineranno (dati non pubblicati in vitro ); anche se questo aumenta anche la possibilità di altre infezioni (ad esempio da un fungo già presente nel giardino fungo), questo periodo di tempo è preferibile per questo trattamento rappresentare la fase iniziale di un’infezione stabilita. Per osservazioni 0 h, direttamente dopo passo 2.6 e circa 30 min prima della registrazione, aggiungere due nidiata, quattro dei lavoratori minori e quattro principali simultaneamente dalla Colonia genitore a ciascuna casella. Utilizzare due operai principali all’interno del giardino che sono giovani con pigmento della luce, con Actinobacteria coprono la maggior parte della cuticola. Prendere le altre due dal fuori del giardino, con pigmento scuro e Actinobacteria solo coprendo le piastre laterocervicale. Per osservazioni di 72h, ripetere 2.8 e 2.8.1 a 30 min prima della registrazione, vale a dire, 71,5 h dopo l’inoculazione con Escovopsis.Nota: Sperimentale Sub-colonie sono significativamente più piccole di naturale Acromyrmex stabiliti colonie. Ciò è necessario al fine di registrare con precisione il comportamento. Mentre questo può influenzare la frequenza di alcuni comportamenti qualitativamente, la composizione delle Sub-colonie fu scelto per riflettere il mix di lavoratori nelle colonie naturali qualitativamente più probabile riflettere le interazioni comportamentali. 3. registrazione video e segnando i comportamenti Utilizzare un endoscopio USB collegato a un computer portatile (o equivalente) e fornire luce sufficiente. Per ogni sub-Colonia, eseguire registrazione video per 4 h (a partire da 0 h o post-infezione 72 h). Dopo aver registrato il 36 Sub-colonie, controlla il totale di 144 h del metraggio e segnare tutti i comportamenti di interesse per tutti gli individui in ogni sub-Colonia.Nota: Nell’esempio corrente sperimentale, abbiamo dovuto escludere due sub-colonie (un controllo dalla Colonia Ae160b) e una subcolonia di trattamento dalla Colonia Ae322 dovuto l’infezione con funghi diverso da Escovopsis, riducendo il numero totale di ore di osservazioni a 136. Ogni volta che un comportamento è stato osservato, registrarlo come 1 occorrenza.Nota: Un comportamento può essere di breve o lunga durata, ma solo il Punteggio > 1 se è interrotto da un altro comportamento, o se la formica è passiva per un periodo di tempo. 4. comportamenti Nota: Le definizioni comportamentali sono state fatte usando una combinazione di descrizioni da precedenti studi23,27,28,31,45 e osservazioni personali. Per un’illustrazione dettagliata una vetrina importante strutture morfologiche utilizzate nel protocollo per il riconoscimento dei comportamenti, vedere Figura 1. Auto-governare e antenna pulizia (Video 1) Avviso se la formica si interrompe il movimento delle gambe per avviare auto-governare. Controllare che le antenne sono tirate attraverso gli addetti alle pulizie dell’antenna sulle gambe anteriori (Figura 1), una struttura a morsetto posizionata sull’articolazione tibia-Tarso costituito da una tacca di fronte uno sperone con diverse dimensioni di setole e pettini45, 46. Dopo la pulizia l’antenna, osservare che la formica pulirà le gambe e gli addetti alle pulizie dell’antenna, tirando le gambe attraverso l’apparato boccale, rimozione di particelle e agenti patogeni potenziali con il glossa (Figura 1).Nota: Self-grooming può consistere di pulizia l’antenna e, successivamente, gli addetti alle pulizie dell’antenna (Figura 1), ma anche utilizzando apparato boccale per pulire le gambe. Quando una formica sta pulendo le sue gambe, più spesso pulisce tutte e sei le gambe in successione. Fungo toelettatura (Video 2) Avviso se la formica smette di movimenti del piedino in un punto fisso sul giardino fungo. Osservare che le antenne sono parallele e immobile puntato verso il fungo in modo che l’angolo tra la scapo e funicolo (Figura 1) è di circa 45 °, e la punta delle antenne sono quasi toccante vicenda, vicino le punte delle mandibole ( Figura 1). Notare che apparato boccale (labium) inferiore e superiore (mascelle) sono aperti, con l’emergere di glossa (Figura 1) a leccare il fungo. Allogrooming (Video 3) Osservare questo comportamento quando uno o più formiche hanno affrontato un’altra formica (destinatario) o viceversa. Durante il comportamento, le formiche arrestano il movimento e stanno molto attentamente insieme con il contatto fisico. La toelettatura ant(s) può spostare leggermente a coprire un’area più grande del corpo della formica destinatario. Osservare che le antenne dei responsabili possono essere immobile e punta verso un punto specifico della formica ricevente o in movimento e toccando leggermente il ricevitore. L’angolo tra lo scapo e il funicolo (Figura 1) è di circa 45 ° a seconda se sono fissi su un punto specifico o intercettazioni. Le punte delle antenne dell’attore sono di solito vicino a vicenda e le punte delle mandibole (Figura 1). Notare che apparato boccale (labium) inferiore e superiore (mascelle) sono aperti, con l’emergere di glossa (Figura 1) a leccare la formica del ricevitore. Metapleural ghiandola toelettatura (Video 4) Osservare quando la formica arresta il movimento di avviare metapleural ghiandola (Figura 1) toelettatura. Si noti che la formica si appoggia da un lato per raggiungere una delle sua schiena gambe anteriori a strofinare l’apertura (meato) della ghiandola di metapleural (ad esempio, la gamba anteriore destra).Nota: L’altra gamba anteriore è contemporaneamente (in questo esempio la zampa anteriore sinistra) leccato da glossa (Figura 1). Verifica che la formica si appoggia al lato opposto e passa le gambe e si ripete lo stesso movimento con le gambe opposte. La formica continua a muovere le zampe anteriori per le ghiandole di metapleural e successivamente il glossa costantemente di commutazione tra le gambe (Figura 1).Nota: In questo esempio, la formica ora passerà la zampa anteriore sinistra alla ghiandola metapleural e la gamba anteriore destra a glossa (Figura 1). Dopo metapleural ghiandola (Figura 1) governare, la formica inizia spesso self-toelettatura (punto 4.1). Spora diserbo (Video 5) Osservare questo comportamento quando la formica smette di movimenti del piedino in un punto fisso sul giardino fungo. Osservare che le antenne sono immobile e paralleli, puntato verso il fungo in modo che l’angolo tra la scapo e funicolo è circa 45°, e le punte delle antenne sono quasi a toccare l’altro e le punte delle mandibole (Figura 1). Verifica che la formica apre le mandibole (Figura 1) per afferrare visibile Escovopsis spore e staccarli dalla coltura fungosa tirandoli. La formica trasporta il cluster di spore fuori dal nido, mentre le antenne sono delicatamente commovente per l’orientamento. Le antenne possono essere pulite attraverso gli addetti alle pulizie dell’antenna (Figura 1; Vedi Video 1) mentre si tiene il cluster di spore. La formica scende le spore in un mucchio di rifiuti.Nota: La registrazione di attività intorno al mucchio dei rifiuti non è stato fatto nell’esperimento attuale ma sarebbe un’estensione adatta dell’attuale protocollo. Fungo diserbo (Video 6) Osservare questo comportamento quando la formica smette di movimenti del piedino in un punto fisso del fungo. Le antenne sono vagamente puntate verso la parte del fungo che la formica sta tentando di rimuovere, mentre toccando leggermente il pezzo di fungo. Osservare che la formica utilizza sue mandibole per entrambi taglio attraverso la coltura fungosa scollegare un’area specificata o per afferrare una parte del pezzo di fungo con le sue mandibole (Figura 1). La formica oscillerà simultaneamente da un lato sulle sue gambe, mentre tira fuori il pezzo di fungo.Nota: Diserbo può essere fatto di più lavoratori e da minori e maggiori. Se è così, alcune formiche fanno il taglio del fungo, altri trasportano fuori il dondolio e tirando il movimento. La parte distaccata del fungo è trasportata fuori dal nido e lasciata nel mucchio dei rifiuti. La registrazione del deposito dei rifiuti non è stato fatto nell’esperimento attuale ma sarebbe un’estensione adatta del protocollo attuale. Liquido fecale toelettatura (Video 7) Osservare questo comportamento quando la formica smette di movimenti del piedino in un punto fisso sul giardino fungo. La formica si piega sua gaster (Figura 1) e la testa verso l’altro per applicare una goccia di liquido fecale per l’apparato boccale. Osservare che la formica tira le gambe anteriori attraverso le mandibole (Figura 1), uno alla volta. Successivamente, la formica si muove le antenne attraverso i pulitori dell’antenna (Figura 1) posizionati sull’articolazione tibia-Tarso delle zampe anteriori. Rigurgito della gocciolina (Video 8) Osservare questo comportamento quando la formica smette di movimenti del piedino in un punto fisso del fungo. Le antenne sono immobile e paralleli, puntato verso il fungo in modo che l’angolo tra la scapo e funicolo è circa 45°, e le punte delle antenne quasi toccare l’altro e le punte delle mandibole (Figura 1). Osservare che la formica rigurgita una gocciolina di liquido verso il fungo, variando dall’essere trasparente alla luce giallo o anche marrone, dal suoi apparato boccale.

Representative Results

L’obiettivo principale di questo studio era la creazione di brevi filmati che illustrano i comportamenti associati a difesa di malattia in formiche tagliafoglie, per generare un catalogo da utilizzare come riferimento per studi futuri. Inoltre, lo studio utilizza un esempio di una messa a punto sperimentale entro il quale questi comportamenti sono stati quantificati per mostrare come questo catalogo può essere utilizzato in studi comportamentali, che i cui risultati rappresentativi riassumiamo qui. Le sub-colonie sono state istituite per l’osservazione in fase precoce (0h) e infezione ritardata di fase (72 h). A causa di infezioni pesanti con funghi diverso da Escovopsis dopo 72 h, sono stati esclusi due sub-colonie (un controllo per Colonia Ae160b) e un trattamento per Colonia Ae322, così abbiamo la presentazione dei risultati a fuoco sul punto di tempo 0 h e mettere meno enfasi comportamenti osservati dopo 72 h. Dopo le riprese tutte le sub-colonie e segnando i comportamenti difensivi, abbiamo trovato le differenze nei modelli di comportamento associati a tempo dopo l’infezione e contesto, tra cui i diversi modi in cui essi sono stati utilizzati dai lavoratori minori e maggiori. Al contrario, auto-governare è stata eseguita tutte le volte in sia controllo che infetti Sub-colonie. Era comune anche quando le formiche erano in Cerca e tentando di rimuovere, Escovopsis IFE o spore. Perché questo comportamento era così universalmente osservata e frequenti in tutte le situazioni, non quantifichiamo esso. Abbiamo segnato tutti gli altri comportamenti descritti nel protocollo e presenti frequenze totali e medie calcolate per piccoli e grandi lavoratori per sub-Colonia (tabella 1). Abbiamo trovato che nei controlli, i lavoratori minori curato il giardino raccolto più di operai principali (Figura 2a) e aneddoticamente osservato che hanno speso più tempo in giardino fungo. Nelle colonie infettati con Escovopsis c’era una tendenza per aumentata fungo governare nel complesso relativo colonie di controllo, ma questo non era significativo (F1,23 = 2,80, p = 0.1077; Tabella 2; Figura 2 un). c’era un aumento non significativo nel governare fecale con infezione (F1,23 = 0,60, p = 0.4455; Tabella 1) ma nessuna differenza tra maggiori e minori lavoratori (Figura 2b). Abbiamo osservato fecale governare quando i lavoratori entrati il fungo, piuttosto che quando erano su o completamente lontano dal fungo per lunghi periodi di tempo. Figura 2: frequenza di toelettatura eventi. Numero medio (± errori Standard (SE); n = 9) (a) fungo toelettatura e (b) fecale del fluido di governare gli eventi entro quattro ore dopo l’inoculazione, confronto tra lavoratori minori e maggiori controlli e trattamenti Escovopsis . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Numerosi comportamenti erano estremamente rari. Abbiamo osservato solo ghiandola metapleural toelettatura quattro volte, e tutte le istanze si è verificato dopo 72 h; volta nel gruppo di controllo e tre volte in colonie con infezione Escovopsis (tabella 1). Quasi come raramente, abbiamo trovato che le formiche sarebbero rigurgitare una goccia di liquido sul giardino fungo e un paio di volte di fuori del fungo (tabella 1). Nei gruppi h 0, questo è successo una volta in una subcolonia di controllo e due volte nelle colonie infetti – in tutti e tre i casi il comportamento è stato effettuato da un grande lavoratore. In un’occasione un lavoratore minore rigurgitato una gocciolina nell’angolo della finestra e una volta che un lavoratore principale ha fatto lo stesso su una foglia di rovo, entrambi nel trattamento Escovopsis . Nelle colonie 72h, rigurgito gocciolina sul fungo era mai osservato nelle colonie controllo ma è accaduto sette volte nelle colonie infetti. Sei di questi erano di grandi lavoratori e tre di questi da un singolo individuo che aggiunto gocce di fuori del giardino di fungo. Spora diserbo (Figura 3un) e fungo diserbo (Figura 3b) erano entrambi di bassa frequenza. Mentre non c’era differenza significativa nella frequenza del fungo diserbo tra colonie infetti e controlli, c’era una tendenza per il diserbo per aumentare con il tempo dall’infezione (F1,23= 2,91, p = 0.1014; Tabella 2). le nostre osservazioni focalizzata sulla spora Escovopsis sarchiatura, che non è cambiato significativamente con il tempo, ma c’era una tendenza ad una maggiore frequenza in colonie infettati con Escovopsis rispetto a comandi non infetti (F1,23 = 3.27, P = 0.0838; Tabella 2). un minor numero di Sub-colonie infettati con Escovopsis avevano visibili spore restanti dopo il periodo di osservazione con un’infezione precoce (quando le formiche sono state introdotte dopo 0 h di inoculazione di spore), con le formiche rimuovendo tutte le spore in quasi metà delle Sub-colonie (4 su 9; Figura 3 c). nelle successive infezioni di fase (dove le formiche sono state introdotte dopo 72 h di inoculazione di spore), le formiche non erano in grado di rimuovere le spore completamente in una qualsiasi delle Sub-colonie. Prese insieme, queste osservazioni suggeriscono una tendenza per le formiche spostare dalla spora diserbo diserbo nel corso di un’infezione del fungo. Figura 3: frequenza di diserbo eventi. Media frequenza (± errori Standard (SE); n = 9) di (a) diserbo spora (di spore Escovopsis ) e (b) fungo diserbo (Escovopsis o altri funghi) durante un periodo di osservazione di 4 h, confrontando i minori e Major da gruppi di trattamento, e ((c)) il numero delle Sub-colonie con visibile Escovopsis spore nei gruppi di trattamento alla fine del periodo di osservazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Lavoratori minori – controllo Lavoratori minori – trattamento Grandi lavoratori – controllo Grandi lavoratori – trattamento 0h Fungo toelettatura 84 (9.333) 131 (14,56) 37 (4.111) 66 (7.333) Allogrooming 6 (0.6667) 14 (1.556) 5 (0.5556) 6 (0.6667) Spora diserbo 0 3 0 5 (0.5556) Fungo diserbo 0 0 0 0 Toelettatura liquido fecale 46 (5.111) 69 (7.667) 27 (3.000) 48 (5.333) Applicazione della gocciolina 0 0 1 (0.1111) 2 (0.2220) Metapleural ghiandola toelettatura 0 0 0 0 72h Fungo toelettatura 10 (1.429) 45 (5.000) 24 (3.429) 38 (4.222) Allogrooming 2 (0.2857) 10 (1.111) 1 (0.1110) 4 (0.4440) Spora diserbo 0 0 0 1 (0.1110) Fungo diserbo 0 1 (0.1110) 0 2 (0.2220) Toelettatura liquido fecale 19 (2.714) 38 (4.222) 30 (4.286) 30 (3,333) Applicazione della gocciolina 0 1 (0.1110) 0 6 (0.6667) Metapleural ghiandola toelettatura 0 2 (0.2220) 1 (0.1429) 1 (0.1110) Tabella 1 : Il numero di comportamenti in quattro ore di osservazione presso 0 e 72 h dopo Escovopsis inoculazione. Il numero totale medio delle osservazioni (con frequenze medie per ogni individuo in parentesi), confrontando i lavoratori maggiori e minori da controllo ed Escovopsis infezione sub-colonie, rispettivamente (n = 9). Prove di tipo 3 degli effetti fissi Fungo toelettatura Allogrooming Toelettatura fecale Spora diserbo Fungo diserbo Effetti Num DF Den DF Valore di F PR > F Num DF Den DF Valore di F PR > F Num DF Den DF Valore di F PR > F Num DF Den DF Valore di F PR > F Num DF Den DF Valore di F PR > F Colonia 2 23 0,77 0.4733 2 23 0,52 0.5989 2 23 0.54 0.5903 2 23 0.51 0.6052 2 23 1.17 0.3272 Sub-Colonia (Colonia) 6 23 0.93 0.4892 6 23 0.51 0.7978 6 23 0,63 0.7067 6 23 1.67 0.1742 6 23 1,53 0.2127 Trattamento 1 23 2.8 0.1077 1 23 1.85 0,1875 1 23 0.6 0.4455 1 23 3.27 0.0838 1 23 1 0.3275 Tempo 1 23 6,53 0.0177 1 23 0.88 0.3574 1 23 0,97 0.3361 1 23 0,53 0.4742 1 23 2,91 0.1014 Tabella 2 : Prove di risultati statistici dell’ANOVA mista su distinti comportamenti per i quali è stato possibile eseguire analisi statistiche. Gli effetti fissi erano Colonia, Sub-Colonia (annidati all’interno della Colonia), trattamento e tempo. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella. Video 1: auto-governare e antenna pulizia. Per favore clicca qui per vedere questo video. Fare clic destro per scaricare. Video 2: fungo toelettatura. Per favore clicca qui per vedere questo video. Fare clic destro per scaricare. Video 3: Allogrooming. Per favore clicca qui per vedere questo video. Fare clic destro per scaricare. Video 4: Metapleural ghiandola toelettatura. Per favore clicca qui per vedere questo video. Fare clic destro per scaricare. Video 5: Spore diserbo. Per favore clicca qui per vedere questo video. Fare clic destro per scaricare. Video 6: fungo diserbo. Per favore clicca qui per vedere questo video. Fare clic destro per scaricare. Video 7: toelettatura liquido fecale. Per favore clicca qui per vedere questo video. Fare clic destro per scaricare. Video 8: rigurgito Droplet. Per favore clicca qui per vedere questo video. Fare clic destro per scaricare.

Discussion

L’obiettivo primario di questo studio era di osservare e comportamenti difensivi caratteristico record di formica tagliafoglie in presenza di infezione del fungo-giardino con Escovopsis, creare filmati di riferimento per utilizzano dalla più ampia comunità scientifica. Si deve osservare che questi comportamenti non sono esclusivi di difesa delle colonie da Escovopsis, ma può anche svolgere un ruolo nella difesa contro altri contaminanti e infezioni⁶^,⁷^,⁸^,⁹ ^,¹⁰^,¹¹^,¹²e nella difesa delle formiche stesse⁴². Il nostro protocollo fornisce uno sfondo per la più ampia ricerca sulle difese dell’organismo in crescita fungo formiche. Questo rischia di essere particolarmente utile: (i) per i giovani ricercatori che non hanno familiari con questi comportamenti; (ii) per garantire la definizioni coerenti per e osservazioni dei comportamenti; (iii) per facilitare i confronti attraverso studi e specie di formiche; (iv) perché un numero di questi comportamenti può verificarsi così di rado che anche sperimentato i ricercatori non potrebbero mai hanno osservato (iv) perché capire e riconoscere i comportamenti in condizioni controllate nella Guida di laboratorio studia in situ dove le condizioni sono più difficili da controllare.

I risultati dal nostro studio comportamentale sono coerenti con il lavoro precedente che ha mostrato che minore lavoratori fungo sposo — cruciale se un’infezione è diagnosticata precocemente — più di grandi lavoratori²⁵^,²⁸^,³². Qui, grandi lavoratori aumentato la quantità di toelettatura fungine dopo Escovopsis infezione (Figura 2a). Ciò suggerisce che i lavoratori minori sono i toelettatori fungo predominante, che grandi lavoratori possono aiutare a prevenire la diffusione di più stabilito infezioni. I più grandi lavoratori principali possono rimuovere le spore più velocemente, mentre minori lavoratori potrebbero essere più adatti a rimuovere le spore meno accessibili. Abbiamo anche trovato che i lavoratori rimosso correttamente spore in circa la metà delle Sub-colonie infetti (quattro su nove) quando sono stati introdotti al momento dell’infezione e quindi in grado di rilevare l’agente patogeno iniziale (Figura 3c). Nel complesso, questo fa riferimento a una serie di risposte comportamentali dove le formiche prima cercano di ferma l’infezione Escovopsis rimuovendo le spore (e facendo così prima un’infezione si diffonde), anziché rimuovere parti del fungo giardino (Figura 3un, b. ). Questo cambia nel corso del tempo se l’infezione progredisce, quando le formiche sono più probabili rimuovere le parti del fungo giardino²⁸. Anche se i nostri campioni di dimensioni erano troppo piccoli per essere conclusivo, e non possiamo escludere che le infezioni simultanee indotto comportamenti sarchiatura, i nostri dati supportano questa tendenza, con il fungo diserbo principalmente essere presente alle fasi successive dell’infezione (Figura 3 una). In genere bassi livelli di fungo sarchiatura potrebbero suggerire che le formiche utilizzato altre difese (ad es., prodotti chimici) per inibire la crescita di Escovopsisulteriormente o che nessuno dei nostri sub-colonie sperimentali erano troppo gravemente infetto (rendendo il più distruttive difese inutili).

I nostri risultati suggeriscono che auto-governare con liquido fecale è caratteristica di formiche entrare nel giardino di fungo e usato come misura profilattica, piuttosto che essere associato a un’infezione. Osservazioni simili sono stata osservate nelle femmine di fondatrice che pulirsi e trasferire le goccioline fecale con la loro bocca alle loro gambe, entrando nel nido o maneggiare il raccolto²⁷. Un’infezione dovrebbe in teoria aumentare l’attività dei lavoratori al bordo del giardino fungo, se il materiale infetto rimosso è effettuato ed eliminato in mucchi di rifiuti. Quindi, toelettatura liquido fecale anche indirettamente può aumentare durante l’infezione per ridurre al minimo la diffusione della malattia. Ci si aspetterebbe il modello opposto per infezioni gravi, con ridotto movimento al bordo del giardino fungo, come lavoratori abbandonano il fungo o adottano misure più estreme come la difesa chimica.

Mentre fluidi fecale potrebbero servire come un profilattico importante chimici per un individuo, allogrooming è utilizzato da compagni di nido su altri lavoratori se rilevano particelle estranee o microbi. La sostanziale differenza che abbiamo osservato tra la frequenza (tabella 1) di toelettatura liquido fecale (n = 304) e di allogrooming (n = 48) potrebbe indicare una differenza nel rilevamento del patogeno. Le formiche non sono in grado di individuare facilmente gli agenti patogeni su se stessi con le loro antenne; allogrooming, d’altra parte, è fatto da compagni di nido, che possono controllare l’intero corpo di una formica e scegliere solo per lo sposo se necessario. Poiché Escovopsis è un parassita del giardino di fungo, piuttosto che le formiche, questo potrebbe anche spiegare la bassa quantità di allogrooming.

Abbiamo osservato raramente ghiandola metapleural governare e solo agli stadi avanzati dell’infezione. Specie di fungo-crescente formiche con abbondanti Pseudonocardia batterica copertina sposo le ghiandole di metapleural meno di specie con meno o no coprire²⁵^,⁴⁷. Come a. echinatior ha un’abbondanza del simbionte⁴⁷, questo potrebbe spiegare la ghiandola bassa frequenza di toelettatura. La secrezione della ghiandola di metapleural è anche costosa per produrre³⁰e può essere conservata all’interno della tasca infrabuccal per lunghi periodi di tempo, in cui la necessità per la cura della ghiandola metapleural potrebbe essere poco frequente. Durante metapleural ghiandola toelettatura, le formiche contemporaneamente passare le gambe e leccano la gamba che aveva appena curato la ghiandola; le spore vengono quindi trasferite alla tasca infrabuccal, dove le secrezioni della ghiandola sono critiche per l’inibizione Escovopsis‘ potenziale per germinazione successivi²⁵. Lavoratori minori sono più abbondanti all’interno del nido e hanno più grandi ghiandole di metapleural per unità di massa corpo³⁰, suggerendo che sono responsabili della maggior parte delle secrezioni della ghiandola metapleural. Questo potrebbe anche spiegare perché, nel nostro studio, la frequenza più elevata di fungo grooming è stato tra i lavoratori minori.

Ci aspettavamo di osservare il regalo che indica attivo uso degli antibiotici dal simbionte batterico Pseudonocardia, comunemente osservato sulla cuticola dei lavoratori Acromyrmex e conosciuto per svolgere un ruolo nella difesa contro Escovopsis ³⁶ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰. la spiegazione più probabile di non osservare tale comportamento, è che l’applicazione di questi antibiotici può essere incorporato in altri comportamenti, come auto-governare seguita da fungo toelettatura e/o diserbo, che può rendere difficile osservare come un comportamento distinto.

Abbiamo osservato il comportamento insolito di rigurgitare le goccioline di liquide sul giardino fungo. Rigurgito di cibo per membri ancora in vita è stata descritta in precedenza, formiche tagliafoglie²². Nel nostro esperimento, goccioline hanno differito da nel colore da trasparente a colore marrone scuro, suggerendo che potrebbe essere una fonte di cibo per altre formiche e/o fornire acqua. Abbiamo osservato solo due occasioni dove altre formiche bevevano dalle goccioline, quindi non possiamo determinare se le goccioline beneficiare altre formiche o servono per reidratare il fungo quando l’umidità è bassa. Maggior parte delle osservazioni di questo comportamento sono stati durante le infezioni Escovopsis , che potrebbero implicare un ruolo difensivo, come innesco immune dal rigurgito di peptidi antimicrobici¹⁶^,⁴⁸. Non possiamo trarre conclusioni definitive su questo dato che questo comportamento era raro, ma sarebbe una linea interessante per indagare ulteriormente, ad esempio, di determinare se le gocce hanno proprietà antimicrobiche.

Dato che gli studi d’osservazione dei comportamenti complessi difensivi di formiche foglia-taglierina, compreso qualsiasi confronto con e senza infezione da fungo giardino, sarebbe estremamente difficile da fare nel campo, dati sperimentali in grado di fornire preziose informazioni questi comportamenti sotto condizioni più controllate. Mentre le osservazioni fatte in condizioni di laboratorio possono differire dai comportamenti trovati in condizioni naturali, strumenti come il nostro catalogo di comportamenti difensivi chiavi bisogno di essere sviluppato, per migliorare sia sperimentale e campo studia in futuro. L’approccio sperimentale può, tuttavia, parzialmente spiegare perché alcuni comportamenti erano estremamente rari (ad es., allogrooming, metapleural ghiandola toelettatura) nella nostra dimostrazione dell’utilizzo di queste definizioni comportamentali. Gli studi futuri potrebbero pertanto considerare le limitazioni di questa messa a punto sperimentale, di trovare il modo di fare osservazioni più naturali. Fattori aggiuntivi potrebbero essere integrati anche nel protocollo attuale, ad esempio distinguendo tra Actinobacteria-trasportare i lavoratori (più giovani) e dei lavoratori anziani con copertura meno abbondante, che potrebbe rispondere in modo diverso alla minaccia di un Escovopsis infezione. Ci sono trade-off tra la osservazioni più accurate (ad esempio segnando focali individui), o avere più grande dimensione della Sub-Colonia (maggior numero di lavoratori) e la quantità di tempo o numero di Sub-colonie o individui che può essere girato a un determinato punto nel tempo. Tuttavia, mentre il set-up potrebbe essere esteso per i più grandi studi comportamentali con un focus su come affrontare un obiettivo comportamentale, in questo caso ci siamo concentrati sulla vetrina con successo un metodo per la registrazione e la definizione di specifici comportamenti difensivi.

Abbiamo documentato i comportamenti che contribuiscono alla difesa in formiche tagliafoglie, e più significativamente, hanno sistematicamente identificato, descritto e catturato comportamenti difensivi sulla pellicola. I nostri risultati rappresentativi rafforzano altre ricerche in questo campo suggerendo perché è difficile per un agente patogeno di infettare con successo le colonie di formiche coltivano funghi, quando di fronte un vasto insieme di comportamenti difensivi e associati applicazione di antimicrobico composti. Il nostro obiettivo principale era quello di fornire un nuovo strumento per il lavoro futuro in questo campo, e ci auguriamo che il catalogo comportamentale si rivelerà prezioso per la protezione di consenso e razionalizzato le definizioni, osservazioni e interpretazioni dei comportamenti, per servire come una risorsa importante per la ricerca futura.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare linea Vej Ugelvig e Kirsten Sheehy per utili discussioni per quanto riguarda la toelettatura meccanismi dei pulitori dell’antenna e le riprese di set-up. Michael Poulsen è supportato da un Villum Kann Rasmussen Young Investigator Fellowship (VKR10101) e Tabitha innocente di un europeo individuali Marie Curie fellowship (IEF concedere 627949). Vorremmo anche ringraziare il Smithsonian Tropical Research Institute per l’utilizzo di strutture e supporto logistico a Panama e la Autoridad Nacional del Ambiente per l’autorizzazione a raccogliere ed esportare le formiche in Danimarca.

Materials

Plastic boxes	N/A	N/A	Transparent. Length: 3.15 in (8 cm), width: 2.17 in (5.5 cm), depth: 1.77 in (4.5 cm)
Petri dishes	Sarstedt	82.1472	3.62×0.63 in (9.2×1.6 cm)
Inoculation loops	Labsolute	7696431	Disposable 1uL. Length: 7.67 in (19.5 cm)
Cameras	DBPower	NTC50HD_8.5mm	USB Endoscope Camera
Holders for the cameras	N/A	N/A	Old beaker clamp stand.
Laptop	HP	N/A	Generic laptop for saving recordings.
Program used on the laptop	Windows Movie maker	N/A
Forceps	Vermandel	50.054	Soft
Potato dextrose broth	Sigma-Aldrich	P6685-1KG	24 g/L

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Nilsson-Møller, S., Poulsen, M., Innocent, T. M. A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants. J. Vis. Exp. (140), e58420, doi:10.3791/58420 (2018).

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