A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants

Stephen Nilsson-M&#248;ller; Michael Poulsen; Tabitha M. Innocent

doi:10.3791/58420

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Behavior

Un Guide visuel pour étudier les défenses comportementales à pathogène s’attaque à fourmis coupe-feuille

Published: October 12, 2018

doi:

10.3791/58420

Stephen Nilsson-Møller¹, Michael Poulsen¹, Tabitha M. Innocent¹

¹Centre for Social Evolution, Section for Ecology and Evolution, Department of Biology,University of Copenhagen

Summary

Nous présentons un guide visuel pour les comportements de défense de la maladie dans les fourmis phyllophages, avec des séquences individuelles et les définitions connexes, illustrées dans un scénario d’infection expérimentale. Notre but principal est d’aider les autres chercheurs à reconnaître les comportements défensifs clés et à fournir une compréhension commune des recherches futures dans ce domaine.

Abstract

Le mode de vie complexe, l’histoire évolutive de la coopération avancée et les défenses de la maladie de fourmis coupe-feuille sont bien étudiés. De nombreuses études ont décrit les comportements liés à la défense de la maladie et l’usage associé à des produits chimiques et d’agents antimicrobiens, aucune référence visuelle commune n’a été déposée. L’objectif principal de cette étude était d’enregistrer de courtes séquences de comportements impliqués dans la défense de la maladie, tant prophylactique que directement ciblée vers un antagoniste de la colonie suite à une infection. Pour ce faire, nous avons utilisé une expérience de l’infection, avec des colonies de l’espèce de fourmi coupe-feuille Acromyrmex echinatioret la plus grande menace de pathogène connue de cultures fongiques des fourmis (Leucoagaricus gongylophorus), spécialisé champignon pathogène du genre Escovopsis. Nous avons filmé et comparé des colonies infectées, à des stades précoces et plus avancés de l’infection. Nous avons quantifié les comportements défensifs clés dans l’ensemble des traitements et montrent que la réponse comportementale à l’attaque de pathogènes susceptible varie selon les différentes castes d’ouvrières et entre la détection précoce et tardive d’une menace. Basé sur ces enregistrements, que nous avons fait une bibliothèque de clips comportementales, accompagnée des définitions des principaux comportements défensifs individuels. Nous prévoyons que ce guide peut fournir un cadre commun de référence pour les autres chercheurs travaillant dans ce domaine, de reconnaître et d’étudier ces comportements et également fournir une plus grande portée pour la comparaison de différentes études pour finalement aider à mieux comprendre le rôle ces comportements jouent dans la défense de la maladie.

Introduction

Les fourmis phyllophages sont avancés des insectes sociaux, formant certaines des colonies plus complexes sur la terre. Ils sont une branche dérivée des fourmis cultivant (tribu Attini) composé de deux genres Acromyrmex et Atta¹. Ils cultivent les espèces de cultures fongiques Leucoagaricus gongylophorus (Basidiomycota : Agaricales), dont ils dépendent comme leur source de nourriture principale²^,³. Les fourmis fournissent ce champignon avec des matériaux de feuille fraîche pour sa croissance, et le champignon produit en retour gonflées extrémités des hyphes riches en éléments nutritifs (gongylidia) dont sont nourrissent les fourmis et leur couvain. Colonies sont construites sous terre, la culture fongique est entretenue dans les jardins extérieurs⁴^,⁵, et les agriculteurs de fourmi protègent leur monoculture de récolte d’éventuels agents pathogènes⁶^,⁷^,⁸ ^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Colonies divisent le travail entre les travailleurs de différentes tailles (castes) et âge¹³^,¹⁴^,¹⁵, qui s’étend à la défense des fourmis et des cultures de germes pathogènes.

Nous pourrions nous attendre à que les colonies de fourmis coupe-feuille soient vulnérables à la maladie. La vie en groupe est censée faciliter la propagation de maladies entre travailleurs assimilés en raison des interactions fréquentes et, par conséquent, plus facile transmission¹⁶. Les fourmis sont sensibles aux parasites champignons entomopathogènes, tels que les espèces de Metarhizium et Beauveria bassiana⁶. Ces parasites sont généralistes et sont souvent présents dans le sol à proximité des nids⁷^,⁸. Élevage de la crème de champignon comme une monoculture⁴^,⁵ rend susceptibles d’être aussi sensibles à la maladie de¹⁷^,¹⁸. Il peut être infecté par des parasites fongiques généraliste (y compris d’espèces Aspergillus niger et Trichoderma ³) ; Cependant, la menace la plus importante est un champignon de nécrotrophe spécialiste du genre Escovopsis (Ascomycota : Hypocreales)¹¹. Par le biais de la sécrétion des enzymes mycolytique et d’autres composés, Escovopsis tue et obtient des éléments nutritifs du champignon culture¹², avec des conséquences potentiellement fatales pour la fourmi colonies¹¹^,¹⁹.

Pour lutter contre les menaces de maladies, les fourmis ont des défenses remarquables au niveau individuel et colonie, combinant la lutte biologique, les défenses comportementales et chimiques d’agir à titre prophylactique et, lorsque nécessaire, en réponse à l’infection. Collectivement, ces défenses prévenir ou réduisent l’impact des infections pathogènes généralistes et spécialistes comme Escovopsis. Globalement, ils impliquent en évitant la contraction des parasites dans l’environnement²⁰, empêcher les parasites d’entrer dans le nid et limiter la propagation de l’infection dans les nids. Les premières lignes de défense comprennent des produits chimiques de sécrétions glandulaires³^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^, ²⁷ pour désinfecter des substrats végétaux, par l’intermédiaire de travailleurs leur lécher avant l’incorporation dans le jardin de champignon et les fourmis transportant les deux auto – et allotoilettage. Quand le toilettage eux-mêmes, en particulier en entrant dans le nid, travailleurs peuvent également s’appliquer les sécrétions acides de selles à leur corps²⁷. Ces défenses prophylactiques sont manifestement importants éviter l’infection par des pathogènes menaces⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^, ¹².

Si les défenses initiales échouent et un agent pathogène comme Escovopsis réussit à entrer dans le nid et le jardin de champignon, et si l’infection est détectée à un stade précoce, les fourmis utilisent champignon toilettage pour éliminer les spores²⁵^,²⁸_. Les fourmis peuvent appliquer des sécrétions des glandes métapleurale ou transférer les spores dans la poche d’infrabuccal (une cavité buccale), où ils sont mélangés avec un cocktail de produits chimique contenant de sécrétions glande métapleurale et labiale²⁶. Il y a plus de 20 composés connus dans ces glandes, y compris les γ – céto-, carboxylique- et indoleactic des acides³. Ceux-ci sont activement appliquée²⁵, ont des propriétés antibiotiques, fongistatique et fongicide²⁹et peuvent inhiber de la germination des spores Escovopsis ³⁰. Stocké dans la poche d’infrabuccal les spores sont plus tard expulsés à l’extérieur de la colonie³¹^,³². La plupart de ce champignon toilettage suite à détection précoce est effectuée par des travailleurs mineurs²⁸^,,³³. Toutefois, si un agent pathogène réussit à éviter la détection et se propage dans le jardin de champignon, deux travailleurs mineurs et majeurs des mauvaises herbes les parties contaminées du champignon²⁸et ce matériau enlevé est déposé à l’extérieur du nid³¹. En outre, les espèces du genre phyllophages Acromyrmex utiliser la lutte biologique sous forme d’antibiotiques produites par symbiotique Actinobacteria³⁴^,³⁵^,³⁶— maintient sur la fourmi cuticule³⁷surtout de jeunes travailleurs majeurs³⁴^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰— pour produire des composés qui empêchent la croissance mycélienne de Escovopsis ³⁴ ^, ³⁸ ^, ⁴¹. cette production d’antibiotiques peut à son tour être détériorée par Escovopsis-a produit des composés au cours d’une infection à¹⁹.

Figure 1 : caractéristiques morphologiques Ant. Un schéma d’une fourmi montrant les structures morphologiques mentionnées dans le protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Défenses de fourmi coupe-feuille constituent donc un ensemble intégré des mécanismes comportements et chimiques qui fournissent collectivement ces fourmis avec protection très efficace contre la maladie⁴². Comprendre ces défenses est d’intérêt général, et ils ont été largement documentés¹⁶^,²⁰^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴. Toutefois, une compilation visuelle des comportements défensifs qui aiderait la définition claire et la description de leur utilisation systématique par les chercheurs sont, à notre connaissance, n’est pas disponible. Bien que la terminologie utilisée pour décrire le comportement de la fourmi est relativement standardisée, il n’y a donc aucune certitude que les mêmes actes comportements sont nommés régulièrement dans différentes études. Ici, notre objectif principal est d’y remédier en apportant clarté et normalisation grâce à une compilation d’enregistrements vidéo des comportements individuels prophylactiques et défensives, accompagnée des définitions associées. Nous avons filmé ces clips pendant une expérience comportementale, où nous avons observé et quantifié les comportements dans le cadre des infections expérimentales de Escovopsis des colonies sous Acromyrmex echinatior , dont les résultats nous présentons également ici comme un exemple illustrant comment cette compilation peut être utilisée pour les études comportementales.

Protocol

1. isolement de Escovopsis Isoler les souches Escovopsis de colonies de Acromyrmex echinatior de laboratoire, en plaçant des fragments jardin de champignon, avec les fourmis enlevés, sur une boîte de Pétri avec de la laine de coton humide pendant plusieurs jours jusqu’à ce que Escovopsis germe et sporule. Transférer des spores à des plaques de gélose de dextrose (PDA, 39 g/L) de pommes de terre et incuber à environ 23° C pendant environ deux semaines.Remarque : Une souche a été utilisée dans la présente étude. Utiliser une aiguille stérile pour dégager des spores mûres de ces premières plaques. Prenez assez de spores pour couvrir la pointe de l’aiguille. Ensemencer les spores sur les nouvelles plaques dans des conditions stériles et incuber à ~ 23 ° C, pendant environ deux semaines. Lorsque les hyphes ont recouvert la plaque entière et développée dans les spores brunes matures, répétez l’étape 1.3 mais cette fois avec des spores de la nouvelle plaque de PDA. Répétez le processus jusqu’à ce qu’un stock propre de Escovopsis pour chaque souche est acquis (aucun contaminant visible de plus en plus sur ou sous la surface de la plaque). 2. expérimental Utilisez trois colonies d’a. echinatior .Remarque : Ici les colonies Ae160b, Ae322 et Ae263 ont été utilisés. De chaque colonie, faire 12 colonies secondaires. Faire six colonies sous observation après 0 h et six sous observation après 72 h. Cela donne un total de 36 colonies secondaires ; Marquez la moitié des colonies secondaires de chaque colonie de « parent » dans le contrôle et l’autre moitié comme « Traitement deEscovopsis ».Note : Bien que dans les colonies de parent la présence d’une reine affecte le comportement du travailleur, nous attendons (bien que cela n’est pas garantie), que les colonies secondaires sans reine sont susceptibles de se comporter comme ceux colonies pendant la courte période de temps qui va de l’expérience. Pour chaque colonie secondaire, utilisez une boîte carrée de la longueur : ~ 3,15 po (8 cm), largeur : ~ 2,17 de 5,5 cm et profondeur ~ 1,77 po (4,5 cm).Remarque : Le point important est de fournir suffisamment d’espace pour les fourmis à l’extérieur le fragment de champignon à s’alimenter et d’immerger des déchets, mais en même temps pour faire la boîte assez petit que le tournage et le comportement de reconnaissance est réalisable. Pour chaque colonie subsidiaire, ajouter un morceau de cuillère de taille (environ 2,2 cm3 et 1.2 g) de la partie centrale du jardin champignon (gongylophorus L.) de la colonie d’origine, quelques feuilles de ronce, et un morceau d’ouate imbibé d’eau.Remarque : La laine de coton apporte humidité. Il ne devrait pas être dégoulinant d’eau et ne doit pas toucher le jardin de champignon. Pour les colonies secondaires traitées avec Escovopsis, utiliser une boucle de l’inoculation et combler l’ouverture donc elle est juste couverte par des spores de Escovopsis . Inoculer les spores en tapotant doucement une petite partie localisée du jardin champignon dix à vingt fois, pour que les spores ne sont pas trop concentrées. Pour les colonies secondaires utilisés comme témoins, imiter la demande de Escovopsis du jardin de champignon avec une anse à inoculation stérile.Remarque : Bien que cela n’était pas fait dans la présente expérience, l’inoculation d’une poudre stérile (comme le graphite ou de la poudre de talc) peut s’effectuer à ce stade de faire la différence entre une infection par un agent pathogène et un agent inerte. Pour les observations de 72 h, laisser la moitié des colonies secondaires (contrôle et infecté) pendant 72 h après l’introduction du Escovopsis avant d’ajouter les fourmis ou lancer l’enregistrement vidéo.Remarque : En attente de 72 h, en l’absence de fourmis, il est probable que Escovopsis spores peuvent germer (données non publiées in vitro ) ; même si cela accroît également le risque d’autres infections (par exemple, d’un champignon déjà présent dans le jardin de champignon), cette période est préférable pour ce traitement représenter le stade précoce d’une infection établie. Pour 0 h observations, directement après l’étape 2.6 et environ 30 min avant l’enregistrement, ajouter deux couvées, quatre travailleurs mineurs et quatre majeurs en même temps de la colonie de parent à chaque boîte. Utilisez deux grandes ouvrières de dans le jardin qui sont jeunes avec pigment de la lumière, avec Actinobacteria couvrant la majeure partie de la cuticule. Prendre les deux autres d’extérieur du jardin, avec pigment foncé et Actinobacteria couvrant uniquement les plaques laterocervical. Pour les observations de 72 h, répétez 2.8 et 2.8.1 à 30 min avant l’enregistrement, soit71,5 h après inoculation avec Escovopsis.Remarque : Expérimentales colonies secondaires sont sensiblement plus petits que les colonies établies d’Acromyrmex naturels. Ceci est nécessaire afin d’enregistrer avec précision le comportement. Tandis que ceci peut influer sur la fréquence de certains comportements qualitativement, la composition des colonies secondaires a été choisie pour refléter la composition de travailleurs dans les colonies naturelles plus probablement qualitativement refléter les interactions comportementales. 3. enregistrement vidéo et la notation des comportements Utiliser un endoscope USB attaché à un ordinateur portable (ou équivalent) et fournir suffisamment de lumière. Pour chaque colonie secondaire, effectuer un enregistrement vidéo pendant 4 h (commençant à 0 h ou infection après 72 h). Après avoir enregistré les 36 colonies secondaires, revoir le montant total de 144 h de séquences et de score tous les comportements d’intérêt pour tous les individus dans chaque colonie sous.Remarque : Dans l’exemple expérimental actuel, nous avons dû exclure deux colonies secondaires (un contrôle de la colonie Ae160b) et une colonie sous traitement de colonie Ae322 due à une infection par des champignons autres Escovopsis, réduisant le nombre total d’heures d’observations 136. Chaque fois qu’un comportement est observé, enregistrer en tant que 1 occurrence.Remarque : Un comportement peut être de courte ou de longue durée, mais seulement de score il > 1 si elle est interrompue par un autre comportement, ou si la fourmi est passive pendant une période de temps. 4. les comportements Remarque : Définitions comportements ont été faites en utilisant une combinaison de descriptions de précédentes études23,27,28,31,45 et observations personnelles. Pour obtenir une illustration détaillée présentant des structures morphologiques importantes utilisées dans le protocole de reconnaissance des comportements, voir la Figure 1. Antenne de nettoyage et toilettage (Vidéo 1) Notez si la fourmi arrête le mouvement de la jambe pour lancer le toilettage. Vérifiez que les antennes sont tirés à travers les nettoyeurs d’antenne sur les pattes avant (Figure 1), une structure de type pince située sur l’articulation du tarse-tibia consistant en un cran face à un éperon avec différentes taille soies et peignes45, , 46. Après le nettoyage de l’antenne, observer que la fourmi nettoiera les jambes et les nettoyeurs de l’antenne, en tirant les jambes à travers les pièces buccales, enlever les particules et les pathogènes potentiels avec la glossa (Figure 1).Remarque : Toilettage peut se composer de nettoyage de l’antenne et par la suite les nettoyeurs de l’antenne (Figure 1), mais aussi à l’aide de pièces buccales pour nettoyer les pieds. Lorsqu’une fourmi est le nettoyage de ses jambes, il nettoie plus souvent tous les six pattes dans la succession. Champignon toilettage (vidéo 2) Avis la fourmi s’arrête à un point fixe, les mouvements de jambe sur le jardin de champignon. Observer que les antennes sont immobiles et parallèle pointait vers le champignon afin que l’angle entre le scape et funicule (Figure 1) est d’environ 45 °, et l’extrémité des antennes se touchent presque, à proximité de l’extrémité de la (mandibules La figure 1). Notez que l’empeigne (maxilles) et inférieurs buccales (labium) sont ouverts, avec l’émergence de glossa (Figure 1) à lécher le champignon. Allotoilettage (vidéo 3) Observer ce comportement lorsqu’un ou plusieurs fourmis ont abordé une autre fourmi (bénéficiaire) ou vice versa. Pendant le comportement, les fourmis l’arrêt du mouvement et sont étroitement solidaires avec un contact physique. Le toilettage ant(s) peut-être se déplacer légèrement couvrir une plus grande surface du corps de la fourmi destinataire. Observer que les antennes de la période 20062013 peuvent être immobile et pointé vers un point spécifique du récepteur de fourmi ou se déplaçant et tapotant légèrement le récepteur. L’angle entre le scape et le funicule (Figure 1) est à environ 45 °, selon si elles sont fixées sur un point spécifique ou un taraudage. Le bout des antennes de l’acteur est habituellement près les uns des autres et les conseils des mandibules (Figure 1). Notez que l’empeigne (maxilles) et inférieurs buccales (labium) sont ouverts, avec l’émergence de glossa (Figure 1) à lécher la fourmi de récepteur. Toilettage de glande métapleurale (Video 4) Observer quand la fourmi arrête le mouvement de lancer métapleurale toilettage de glande (Figure 1). Notez que la fourmi se penche d’un côté pour atteindre un des son dos pattes avant de frotter l’ouverture (méat) de la glande métapleurale (par exemple, le pied avant droit).Remarque : L’autre patte avant est simultanément (dans cet exemple la patte avant gauche) léchée par la glossa (Figure 1). Vérifier que la fourmi se penche vers le côté opposé et commute les jambes et répète le même mouvement avec les jambes opposées. La fourmi continue de bouger les jambes avant les glandes métapleurale et ensuite la glossa constamment basculer entre les jambes (Figure 1).Remarque : Dans cet exemple, la fourmi passera désormais la patte avant gauche de la glande métapleurale et le pied avant droit de la glossa (Figure 1). Après la glande métapleurale (Figure 1) toilettage, la fourmi déclenche souvent Self toilettage (étape 4.1). Spore désherbage (vidéo 5) Observer ce comportement lorsque la fourmi s’arrête les mouvements de jambe à un point fixe sur le jardin de champignon. Observer que les antennes sont immobiles et parallèles, pointé vers le champignon afin que l’angle entre le scape et funicule est d’environ 45°, et les conseils des antennes sont touchent presque les uns des autres et les conseils des mandibules (Figure 1). Vérifier que la fourmi ouvre ses mandibules (Figure 1) pour récupérer les spores de Escovopsis visibles et détacher de la culture fongique en les tirant. La fourmi transporte l’amas de spores hors du nid, tandis que les antennes sont légèrement mobiles pour l’orientation. Les antennes peuvent être nettoyés par les nettoyeurs de l’antenne (Figure 1, voir Video 1) tout en maintenant l’amas de spores. La fourmi dépose les spores dans un tas de déchets.Remarque : Enregistrement d’activité autour de la pile de déchets ne se faisait pas dans l’expérience en cours, mais serait une extension appropriée du protocole actuel. Champignon désherbage (vidéo 6) Observer ce comportement lorsque la fourmi s’arrête à un point fixe du champignon, les mouvements de jambe. Les antennes sont vaguement pointés vers la partie du champignon que la fourmi tente de supprimer, tout en tapotant légèrement la pièce champignon. Observer que la fourmi utilise ses mandibules pour chaque coupe à travers la culture fongique pour détacher une zone déterminée, ou de récupérer une partie de la pièce de champignon avec ses mandibules (Figure 1). La fourmi simultanément oscille d’un côté à l’autre sur ses jambes, alors qu’elle enlève le morceau de champignon.Remarque : Désherbage peut être fait par plusieurs travailleurs et par les mineurs et majeurs. Si donc, des fourmis font la coupe champignon, d’autres effectuer la bascule et tirant sur le mouvement. La partie détachée du champignon est à l’extérieur du nid et déposer dans le tas de déchets. Enregistrement du gisement des déchets ne se faisait pas dans l’expérience en cours, mais serait une extension appropriée du protocole actuel. Selles liquide toilettage (vidéo 7) Observer ce comportement lorsque la fourmi s’arrête les mouvements de jambe à un point fixe sur le jardin de champignon. La fourmi plie son gaster (Figure 1) et la tête vers l’autre pour appliquer une goutte de liquide fécal pour les pièces buccales. Observer que la fourmi tire les pattes à travers les mandibules (Figure 1), un à la fois. Par la suite, la fourmi déplace les antennes à travers les nettoyeurs de l’antenne (Figure 1) situés sur la commune de tibia-Tarse des pieds avant. Régurgitation de gouttelettes (Video 8) Observer ce comportement lorsque la fourmi s’arrête à un point fixe du champignon, les mouvements de jambe. Les antennes sont immobiles et parallèles, pointé vers le champignon afin que l’angle entre le scape et funicule est d’environ 45°, et les conseils des antennes presque touchent mutuellement et les pointes des mandibules (Figure 1). Observer que la fourmi régurgite une goutte de liquide sur le champignon, variant de faire preuve de transparence à la lumière jaune ou même brun, de ses pièces buccales.

Representative Results

L’objectif principal de cette étude a été la création de courtes séquences illustrant des comportements associés à la défense de la maladie dans les fourmis phyllophages, pour générer un catalogue à utiliser comme référence pour de futures études. En outre, l’étude utilise un exemple d’un montage expérimental dans lequel ces comportements ont été quantifiées pour montrer comment ce catalogue peut être utilisé dans les études comportementales, que dont les résultats représentatifs, nous résumons ici. Sub-colonies ont été mis en place pour l’observation au stade précoce (0 h) et l’infection tardive de scène (72 h). En raison de fortes infections par champignons autres que Escovopsis après 72 h, deux colonies secondaires (un contrôle pour la colonie Ae160b) et un traitement pour la colonie Ae322 ont été exclus, alors nous nous concentrons la présentation des résultats sur le point de temps de 0 h et mettre moins l’accent comportements observés après 72 h. Après le tournage de toutes les colonies secondaires et marquant les comportements défensifs, on observe des différences dans les comportements associés à temps après l’infection et le contexte, y compris les différentes manières dont ils ont été utilisés par les travailleurs mineurs et majeurs. En revanche, toilettage réalisé à tout moment en contrôle et en colonies sous infectés. Il était également courant fourmis étaient recherche, et l’avant de la sortir, les hyphes Escovopsis ou spores. Parce que ce comportement était si universellement observés et fréquentes dans toutes les situations, nous n’ont pas quantifié il. Nous avons marqué tous les autres comportements décrits dans le protocole et le présents fréquences totales et moyennes calculées pour les travailleurs mineurs et majeurs par colonie secondaire (tableau 1). Nous avons constaté que chez les témoins, travailleurs mineurs soigné le jardin récolte plus de grandes ouvrières (Figure 2a), soit dit en passant a observé qu’ils ont passé plus de temps dans le jardin de champignon. Dans les colonies atteintes de Escovopsis il y avait une tendance accrue de champignon toilettage globalement par rapport aux colonies témoins, mais ce n’était pas significatif (F1,23 = 2,80, p = 0.1077 ; Tableau 2; Figure 2 un). il y avait une augmentation non significative en toilettage selles infectées (F1,23 = 0,60, p = 0.4455 ; Tableau 1) mais aucune différence entre les travailleurs mineurs et majeurs (Figure 2b). Nous avons observé fécales toilettage lorsque les travailleurs entrés le champignon, plutôt que quand ils étaient sur ou complètement loin le champignon pendant de longues périodes de temps. Figure 2 : fréquence de toilettage événements. Le nombre moyen (± erreurs-types (SE) ; n = 9) (a) champignon toilettage et (b) fécal de fluide de toilettage des événements dans les quatre heures après l’inoculation, en comparant des travailleurs mineurs et majeurs chez les témoins et les traitements de Escovopsis . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Plusieurs comportements étaient extrêmement rares. Nous avons n’observé que la glande métapleurale toilettage quatre fois, et toutes les instances se sont produites après 72 h ; fois dans le groupe témoin et trois fois dans les colonies Escovopsis infection (tableau 1). Presque aussi rarement, nous avons constaté que les fourmis seraient régurgiter une goutte de liquide sur le jardin de champignon et quelques fois à l’extérieur du champignon (tableau 1). Dans les groupes 0 h, cela est arrivé une fois dans une colonie sous contrôle et deux fois dans des colonies infectées – dans les trois cas, le comportement a été réalisé par un travailleur majeur. Une fois un ouvrier mineur régurgité une goutte sur le coin de la boîte et une fois qu’un travailleur majeur fait de même sur une feuille de ronce, tant dans le traitement de Escovopsis . Dans les colonies de 72 h, régurgitation de gouttelettes sur le champignon n’a jamais été observée dans les colonies de contrôle mais qui s’est passé sept fois dans les colonies infectées. Six d’entre eux ont été de grandes ouvrières et trois d’entre eux par une seule personne qui a ajouté des gouttelettes à l’extérieur du jardin de champignon. Spore désherbage (Figure 3a) et le champignon désherbage (Figure 3b) étaient tous deux de faible fréquence. Alors qu’il n’y avait aucune différence significative dans la fréquence du champignon sarclage entre colonies infectées et les témoins, il y avait une tendance pour le désherbage pour augmenter avec le temps depuis l’infection (F1,23= 2,91, p = 0,1014 ; Tableau 2). nos observations axée sur les spores de Escovopsis désherbage, qui n’a pas changé significativement avec le temps, mais il y avait une tendance à une fréquence plus élevée dans les colonies atteintes Escovopsis que chez les témoins non infectés (F1,23 = 3,27, P = 0,0838 ; Tableau 2). les colonies secondaires moins infectés par Escovopsis avaient des spores visibles restant après la période d’observation avec une infection précoce (quand les fourmis ont été lancées après 0 h d’inoculation de spores), avec les fourmis en supprimant toutes les spores dans presque la moitié des colonies secondaires (4 sur 9 ; Figure 3 c). dans les infections plus tard de scène (où les fourmis ont été introduits après 72 h après l’inoculation de spores), les fourmis n’étaient pas capables d’éliminer les spores complètement dans aucune des colonies secondaires. Pris ensemble, ces observations suggèrent une tendance pour les fourmis de passer de spore désherbage au champignon désherbage au cours d’une infection. Figure 3 : fréquence des événements de désherbage. Moyenne fréquence (± erreurs-types (SE) ; n = 9) (a) désherbage de spore (des spores de Escovopsis ) et (b) champignon désherbage (Escovopsis ou autres champignons) pendant une période d’observation de 4 h, en comparant les mineurs et les commandants des groupes de traitement, et (c) le nombre de colonies secondaires avec des spores de Escovopsis visibles dans les groupes de traitement à la fin de la période d’observation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Travailleurs mineurs – contrôle Travailleurs mineurs – traitement Grandes ouvrières – contrôle Grandes ouvrières – traitement 0h Toilettage de champignon 84 (9.333) 131 (14,56) 37 (4.111) 66 (7.333) Allotoilettage 6 (0,6667) 14 (1,556) 5 (0.5556) 6 (0,6667) Spore désherbage 0 3 0 5 (0.5556) Désherbage de champignon 0 0 0 0 Selles liquides toilettage 46 (5.111) 69 (7,667) 27 (3.000) 48 (5.333) Application de gouttelettes 0 0 1 (0.1111) 2 (0.2220) Toilettage de glande métapleurale 0 0 0 0 72h Toilettage de champignon 10 (1,429) 45 (5.000) 24 (3.429) 38 (4.222) Allotoilettage 2 (0,2857) 10 (1.111) 1 (0.1110) 4 (0.4440) Spore désherbage 0 0 0 1 (0.1110) Désherbage de champignon 0 1 (0.1110) 0 2 (0.2220) Selles liquides toilettage 19 (2.714) 38 (4.222) 30 (4.286) 30 (3.333) Application de gouttelettes 0 1 (0.1110) 0 6 (0,6667) Toilettage de glande métapleurale 0 2 (0.2220) 1 (0.1429) 1 (0.1110) Tableau 1 : Le nombre de comportements en quatre heures d’observation à 0 et 72 h après Escovopsis inoculation. Le nombre total moyen des observations (avec des fréquences moyennes par personne entre parenthèses), en comparant les travailleurs mineurs et majeurs de contrôle et Escovopsis infection secondaire colonies, respectivement (n = 9). Essais de type 3 des effets fixes Toilettage de champignon Allotoilettage Selles de toilettage Spore désherbage Désherbage de champignon Effets Num DF Den DF Valeur de F PR > F Num DF Den DF Valeur de F PR > F Num DF Den DF Valeur de F PR > F Num DF Den DF Valeur de F PR > F Num DF Den DF Valeur de F PR > F Colonie 2 23 0,77 0.4733 2 23 0,52 0.5989 2 23 0,54 0.5903 2 23 0,51 0.6052 2 23 1.17 0.3272 Sous colonie (colonie) 6 23 0,93 0.4892 6 23 0,51 0.7978 6 23 0,63 0.7067 6 23 1,67 0.1742 6 23 1.53 0.2127 Traitement 1 23 2.8 0.1077 1 23 1,85 0,1875 1 23 0,6 0.4455 1 23 3.27 0,0838 1 23 1 0.3275 Temps 1 23 6.53 0,0177 1 23 0,88 0.3574 1 23 0,97 0.3361 1 23 0,53 0.4742 1 23 2.91 0,1014 Tableau 2 : Résultats statistiques d’analyse de la variance mixte des tests sur des comportements distincts pour lesquels des analyses statistiques pourraient être réalisées. Effets fixes ont été colonie, colonie secondaire (imbriquées dans la colonie), traitement et du temps. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau. Vidéo 1 : toilettage et antenne nettoyage. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. Faites un clic droit pour télécharger. Vidéo 2 : champignon toilettage. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. Faites un clic droit pour télécharger. Vidéo 3 : allotoilettage. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. Faites un clic droit pour télécharger. Vidéo 4 : toilettage de glande métapleurale. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. Faites un clic droit pour télécharger. Vidéo 5 : Spore désherbage. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. Faites un clic droit pour télécharger. Video 6 : champignon désherbage. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. Faites un clic droit pour télécharger. Video 7 : selles liquides toilettage. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. Faites un clic droit pour télécharger. Video 8 : la régurgitation Droplet. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. Faites un clic droit pour télécharger.

Discussion

L’objectif principal de cette étude était d’observer et record comportements défensifs caractéristique de fourmi coupe-feuille en présence de l’infection à champignon-jardin avec Escovopsis, création de clips de référence pour utilisent par la communauté scientifique. Il est à noter que ces comportements ne sont pas exclusives à la défense des colonies Escovopsis, mais peut aussi jouer un rôle dans la défense contre d’autres infections et contaminants⁶^,⁷^,⁸^,⁹ ^,¹⁰^,¹¹^,¹²et dans la défense des fourmis se⁴². Notre protocole constitue une toile de fond pour une recherche plus large sur les défenses en cultivant les fourmis. Cela est susceptible d’être particulièrement utile : (i) pour les jeunes chercheurs qui ne sont pas familiers avec ces comportements ; (ii) pour garantir des définitions cohérentes pour et observations des comportements ; (iii) pour faciliter les comparaisons entre des études et des espèces de fourmis ; (iv) parce qu’un certain nombre de ces comportements peut-être se produire si rarement vécue même chercheurs peuvent jamais observé (iv) parce que comprendre et reconnaître les comportements dans des conditions contrôlées à l’aide du laboratoire d’études sur place où les conditions sont plus difficiles à contrôler.

Les résultats de notre étude de comportement concordent avec les travaux antérieurs qui ont montré que mineur travailleurs champignon marié — crucial si une infection est détectée tôt, plus grandes ouvrières²⁵^,²⁸^,³². Ici, les grandes ouvrières a porté le montant de toilettage fongique après Escovopsis infection (Figure 2a). Ceci suggère que les travailleurs mineurs sont les toiletteurs champignon prédominant, mais que grandes ouvrières peuvent aider à prévenir la propagation de plus établi des infections. Les plus grandes ouvrières enlèvent les spores plus rapidement, tandis que les travailleurs mineurs pourraient convenir davantage à la suppression des spores moins accessibles. Nous avons également constaté que les travailleurs a été supprimée le spores dans environ la moitié des colonies sous infectés (quatre sur neuf) lorsqu’ils ont été introduits au moment de l’infection et donc de détecter l’agent pathogène précoce (Figure 3c). Dans l’ensemble, cette pointe vers une série de réponses comportementales où les fourmis essaient d’abord d’arrête Escovopsis infection en enlevant les spores (et faisant alors avant l’infection se propage), au lieu de supprimer des parties du champignon jardin (Figure 3a, b. ). Cela change avec le temps si l’infection progresse, quand les fourmis sont plus susceptibles de retirer des pièces du champignon jardin²⁸. Bien que nos échantillons étaient trop petits pour être concluante, et nous ne pouvons exclure que les infections simultanées induisaient desherbage comportements, nos données prend en charge cette tendance, avec champignon désherbage étant surtout présent à un stade ultérieur de l’infection (Figure 3 un). Généralement de faibles taux de désherbage de champignon pourraient suggérer que les fourmis utilisé autres défenses (p. ex., produits chimiques) pour inhiber la croissance de Escovopsisplus loin, ou qu’aucun de nos colonies secondaires expérimentaux étaient infectés trop sévèrement (fabrication les défenses plus destructrices inutiles).

Nos résultats suggèrent que le toilettage avec liquide fécal est caractéristique des fourmis dans le jardin de champignon et utilisé comme mesure prophylactique, plutôt que d’être associés à une infection. Des observations similaires ont été observées chez les femelles fondatrices qui se toilettent et transfert des gouttelettes fécales avec leur bouche de leurs jambes, lors de l’entrée du nid ou de la manipulation de la culture²⁷. Une infection devrait en théorie augmenter l’activité des travailleurs à l’orée du jardin champignon, si le matériel infecté supprimé est effectué et a chuté dans les piles usées. Par conséquent, fécal fluide toilettage peut augmenter aussi indirectement au cours de l’infection pour réduire au minimum la propagation des maladies. On s’attendrait le modèle opposé pour des infections graves, avec une circulation réduite au bord du jardin champignon, comme travailleurs soit abandonnent le champignon ou adoptent des mesures plus extrêmes telles que la défense chimique.

Tandis que les selles liquides pourraient servir un important prophylaxie chimiques pour un individu, allotoilettage est utilisé par nid-mates sur les autres travailleurs s’ils détectent les particules étrangères ou des microbes. La différence essentielle que nous avons observé entre la fréquence (tableau 1), des selles liquides toilettage (n = 304) et d’allotoilettage (n = 48) peut indiquer une différence dans la détection des pathogènes. Les fourmis ne sont pas en mesure de facilement détecter les agents pathogènes sur eux-mêmes avec leurs antennes ; allotoilettage en revanche se fait par nid-copains, qui peuvent inspecter l’ensemble du corps d’une fourmi et choisir uniquement tailler si nécessaire. Depuis Escovopsis est un parasite du jardin champignon plutôt que les fourmis, ce qui pourrait également expliquer la faible quantité d’allotoilettage.

Nous avons rarement observé glande métapleurale toilettage et seulement à un stade ultérieur de l’infection. Espèce de cultivant fourmis avec abondante couverture bactérienne Pseudonocardia toilettent les glandes métapleurale moins que les espèces avec moins ou non couvrir²⁵^,⁴⁷. Echinatior a. ayant une abondance du symbiote⁴⁷, ceci peut expliquer la glande basse fréquence de toilettage. La sécrétion de la glande métapleurale est aussi cher à produire³⁰et peut-être être conservée dans la poche d’infrabuccal pour longues périodes de temps, ce qui signifie que la nécessité pour le toilettage de la glande métapleurale peut être peu fréquente. Au cours de la glande métapleurale toilettage, les fourmis en même temps changez de jambe et lécher la jambe qui avait soigné vient de la glande ; les spores sont ainsi transférées dans la poche infrabuccal, lorsque les sécrétions de la glande sont essentielles pour inhiber Escovopsis‘ potentiel de germination subséquente²⁵. Ouvriers mineurs sont plus abondantes à l’intérieur du nid et ont des glandes de métapleurale plus grands par unité corps masse³⁰, ce qui suggère qu’ils sont responsables de la majorité des sécrétions de la glande métapleurale. Ceci pourrait également expliquer pourquoi, dans notre étude, la plus haute fréquence de toilettage du champignon est parmi les travailleurs mineurs.

Nous nous attendions à observer les Herpés indiquant active à utiliser des antibiotiques de symbiote bactérien Pseudonocardia, couramment observés sur la cuticule des travailleurs Acromyrmex et connus pour jouer un rôle dans la défense contre Escovopsis ³⁶ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰. l’explication la plus plausible pour ne pas respecter un tel comportement, est que l’application de ces antibiotiques peut-être être incorporée dans les autres comportements, tels que toilettage suivie de champignon toilettage et/ou désherbage, qui peut rendre difficile à observer comme un comportement distinct.

Nous avons observé le comportement inhabituel de régurgiter des gouttelettes de liquide sur le jardin de champignon. Régurgitation de nourriture pour les congénères a déjà été décrit dans de fourmis coupe-feuille²². Dans notre expérience, gouttelettes diffèrent de la couleur transparente à brun foncé, ce qui suggère qu’ils peuvent être une source de nourriture pour les autres fourmis et/ou de fournir de l’eau. Nous avons n’observé que deux occasions où les autres fourmis bu de gouttelettes, afin que nous ne pouvons pas déterminer si les gouttelettes bénéficient d’autres fourmis ou servent à réhydrater le champignon quand l’humidité est faible. Plupart des observations de ce comportement ont été au cours des infections Escovopsis , qui pourraient impliquer un rôle défensif, comme abri d’amorçage par régurgitation de peptides antimicrobiens¹⁶^,,⁴⁸. Nous ne pouvons pas tirer des conclusions fermes sur cela puisque ce comportement était rare, mais ce serait une ligne intéressante de poursuivre l’enquête, par exemple, en déterminant si les gouttelettes ont des propriétés antimicrobiennes.

Étant donné que les études d’observation des comportements défensifs complexes de fourmis coupe-feuille, y compris toute comparaison avec et sans infection fongique des jardin, serait extrêmement difficile à réaliser dans le domaine, les données expérimentales peuvent donner un aperçu précieux ces comportements sous des conditions plus contrôlées. Tandis que les observations faites dans des conditions de laboratoire peuvent différer des comportements trouvés dans des conditions naturelles, des outils tels que notre catalogue de comportements défensifs clés doivent à développer, d’améliorer les deux expérimentale et champ d’études à l’avenir. L’approche expérimentale pourrait, cependant, expliquer en partie pourquoi certains comportements étaient extrêmement rares (p. ex., allotoilettage, toilettage de glande métapleurale) dans notre démonstration de l’utilisation de ces définitions comportementales. Futures études pourraient donc envisager les limites de ce dispositif expérimental, de trouver des façons de faire des observations plus naturelles. D’autres facteurs pourraient également intégrer le protocole actuel, tels que de faire la distinction entre porteurs Actinobacteria (jeunes) travailleurs et les travailleurs âgés avec couverture moins abondante, qui peut réagir différemment à la menace d’un Escovopsis infection. Il y a des compromis entre faire des observations plus précises (par exemple en marquant les personnes focales), ou avoir de plus grande taille de la colonie sous (plus grand nombre de travailleurs) et la quantité de temps ou de nombre de colonies secondaires ou individus qui peut être filmé à une donnée point dans le temps. Néanmoins, alors que la mise en place pourrait être prolongée pour les grandes études comportementales en mettant l’accent sur le traitement d’un objectif comportemental, dans ce cas nous nous sommes concentrés sur l’exposition avec succès une méthode d’enregistrement et de définir les comportements défensifs spécifiques.

Nous avons observé des comportements qui contribuent à la défense en fourmis phyllophages, et plus significativement, ont systématiquement identifiées, décrites et capturé des comportements défensifs sur le film. Nos résultats représentatifs renforcent d’autres recherches dans ce domaine, ce qui semble indiquer pourquoi il est difficile pour un agent pathogène infecte avec succès champignons les colonies de fourmis, lorsque confrontés à un vaste jeu de comportements défensifs et application des antimicrobiens composés. Notre principal objectif était d’offrir un nouvel outil pour les travaux futurs dans ce domaine, et nous espérons que le catalogue comportemental s’avéreront précieux pour obtenir un consensus et définitions simplifiées, observations et les interprétations des comportements, pour servir comme une ressource importante pour de futures recherches.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Vej Ugelvig ligne et Kirsten Sheehy pour des discussions utiles concernant les mécanismes des nettoyants antenne de toilettage et tournage montage. Michael Poulsen est soutenu par un Villum Kann Rasmussen Young Investigator Fellowship (VKR10101) et Tabitha Innocent par un européen individuelles Marie Curie fellowship (FIE Don 627949). Nous tenons également à remercier le Smithsonian Tropical Research Institute pour l’utilisation des installations et un soutien logistique au Panama et la Autoridad Nacional del Ambiente pour obtenir la permission de recueillir et d’exporter des fourmis au Danemark.

Materials

Plastic boxes	N/A	N/A	Transparent. Length: 3.15 in (8 cm), width: 2.17 in (5.5 cm), depth: 1.77 in (4.5 cm)
Petri dishes	Sarstedt	82.1472	3.62×0.63 in (9.2×1.6 cm)
Inoculation loops	Labsolute	7696431	Disposable 1uL. Length: 7.67 in (19.5 cm)
Cameras	DBPower	NTC50HD_8.5mm	USB Endoscope Camera
Holders for the cameras	N/A	N/A	Old beaker clamp stand.
Laptop	HP	N/A	Generic laptop for saving recordings.
Program used on the laptop	Windows Movie maker	N/A
Forceps	Vermandel	50.054	Soft
Potato dextrose broth	Sigma-Aldrich	P6685-1KG	24 g/L

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Nilsson-Møller, S., Poulsen, M., Innocent, T. M. A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants. J. Vis. Exp. (140), e58420, doi:10.3791/58420 (2018).

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