高架プラス迷路外因性ケト原性サプリメントの抗不安薬の効果を調べるためのソフトウェアを追跡するビデオと組み合わせてテスト

南フロリダの大学機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ガイドラインに従って (プロトコル #0006R) は動物の処理および測定プロシージャを行った。すべての努力は、使用される動物の数を減らすために行われました。 1. 準備 注: プロトコル通常必要があります研究所飼育ラットまたはマウス EPM をテストするため。ただし、モルモットなどの動物は、交通13でテストされています。ビデオのトラッキングを使用するときは、迷路の中で動物と迷路の色の色のコントラストを考慮することが重要です。コントラストがライブの動物または経由でビデオを見ている研究者には重要です。追跡ソフトウェアを文書化するように構成しなければ動物ビデオの設定には、黒または黒または白のいずれかの迷路に白がいます。透明なアクリルの迷路の設定で問題が発生するが、マット グレー迷路は両方の齧歯動物の色を最適にすることができます。 本体重量2と同様、ひずみ、セックス、発情サイクルと、年齢などの要因に影響を与える可能性を考慮した実験のために動物を選択します。 個々 の実験に基づいて、テストのグループごとのペット数を決定します。注: グループ サイズは試験治療の予想される効果のサイズに依存になります。電力解析は実験グループの数と同様に、任意のタスク、動物の応答の可変性を与え含まれる科目の最小数を決定するのに実験が開始される前に一般的に行われます。 デザイン実験 (、オープン フィールド テスト、EPM テスト、穴板テスト、および強制水泳テストなど、別の行動テスト バッテリー使用されます) 慎重に。注意: 齧歯動物の EPM テストの直前に (オープン フィールド テスト) など新たなテスト環境への曝露前は、EPM1,2の動物の動作を変更できます。 EPM のテスト前に同様の方法ですべての動物を扱います。注: それが実証されて別のストレス要因、薬 (例えば注射)、送料の応力、および処理のアプリケーションが動作と EPM16齧歯動物の行動応答を変更できます。したがって、動物の家 (例えば出荷、EPM テストの前に 1-2 週間後)、実験的条件および処置 (例えばgavaging) を動物の慣れが必要です。また、齧歯動物、特にすぐに、テスト前に事前のストレッサーの経験の処理、動物および試験治療グループ間で一貫性のあることが重要です。 ラットおよびマウスの動物は、彼らの暗い、アクティブな段階と行動評価を実行できますように逆のライト サイクルを使用してなどの夜行性動物の行動の研究を行います。注: 別の住宅条件と光の効果に及ぼすサイクル/概日リズムと EPM の結果に与える影響を示した以前17動物のホルモンは、光のサイクルによって規制されているので。 手続き中に同じ実験者を使用し、臭気の強い石鹸や香水を避けるためにそれらを求めます。 実験中に話を動物の近くまたは EPM 環境近くのオブジェクトを移動しないこと実験者を求めます。注: それが行動データを収集するときに、オブザーバーで最小限の動きとノイズを作ることが重要です。 探査試験動物に干渉する可能性が以前の動物のあらゆる臭いを消去する各試行後全体の EPM をきれい。 (推奨)EPM テスト (1 〜 2 分押し続けると上体をそっと拾い) の前に数日間、動物を扱う実験者にそれらに適応します。 一貫した方法ですべての動物を処理し、各齧歯動物が、(例えば、実験者から開かれた腕に直面している中心部で) 同じ腕に直面する同じ位置で EPM は、EPM に動物を配置するときを確認します。 2. 外因性ケトン サプリメントの適用 (例えば、胃内強制経口投与) の治療のための投与量の計算を決定するための任意の治療を開始する前に、動物の体重を測定します。 ケトン補充 (標準的な齧歯動物の食事/スタンダード ダイエット [SD] + 水強制経口投与の前に 5 d の水を強制経口投与による胃内強制経口投与法 (適応期間) に動物を理解します。例えば水/日の 2.5 g/kg 体重)。胃内強制経口投与法に適応しない任意の動物の使用を除外します。 83 d の慢性的なため、SD と 7 d のどちらかの水で毎日強制経口投与 subchronically 動物をフィード次の適応期間 (例えば、5 g/kg 体重/日; コントロール グループ: n = 8)、ケトン エステルなどのサプリメントはケトン (柯; 1, 3-ブタンジ オール アセト酢酸ジエステル;例えば、5 g/kg 体重/日;n = 8)、ケトン塩 (KS。Na+/K+\u2012beta-hydroxybutyrate [βHB] ミネラル塩。例えば、5 g/kg 体重/日;n = 8)、または KS + 中鎖トリグリセリド (1:1 の比率、KSMCT;n = 8)18,19,20。注: 胃内強制経口投与を受けた動物は、治療後 EPM 1 h でテストされました。ラットが標準の齧歯動物の食事と gavaged 水 (ケトン補充を除く) 制御グループとして提供しています。 3. 不安アッセイ EPM 装置 研究間で同じ装置を使用して、結果を標準化します。EPM は十字型の装置で、4 本の腕で構成されています (例えば、幅 10 cm、長さ 50 cm、腕があります): 2 つの反対側のアームが開かれ、2 つの反対の腕を閉じる高 (例えば、30 cm) の壁が備わっています。装置は (例えば、55 cm) 床の上高架2。注: 最も一般的に使用されるパラメーターは、開いた腕とオープン腕の中; にエントリの数の累積時間ただし、クローズド アームとセンターに時間し、距離だけでなく、クローズド アームとセンターにエントリの数を測定各地域で旅しました。 間接照明を使用して EPM を光 (すなわち、直接光源が直接 EPM 装置を照明代わりに天井の方) すべての 4 本の腕同様に点灯していることを確認し、(影なしは図 2を参照)。注: 光のレベルの変化は、EPM の齧歯動物の動作を変更します。したがって、連続した実験動物の日 (例えば部屋で 2,800 ルーメン)2と同様の照明が必要です。 ビデオ追跡システム注: は、コンピューターのインターフェイスと自動的に (ラットの行動データを収集するデータ収集用ビデオカメラ システムを追跡ビデオを使用します。図 3).追跡システム、さまざまな標準アナログ カメラまたはユーザー定義のイメージ ソース (赤外線カメラ、ビデオカメラ、WIA に準拠した USB カメラ、ウェブカメラ、ビデオetc.) 使用することができます。録画したビデオを分析、運動追跡ソフトウェアは、.avi、.vob、.wmv、.asf、.mov、.qt、.mpg、.mpeg、.mp4、.3gp、.mkv など、すべての一般的なビデオ フォーマットをサポートします。特定のコーデックを必要とする可能性がありますビデオが正しく再生されない場合その他のビデオ形式は、対応するコーデックがシステムにインストールされている場合にサポートされます。運動追跡ソフトウェアは、以前に取得した動画を分析し、DVD ・ HD レコーダー、デジタル ビデオ ファイル (.avi、.divx、.mpeg などの異なるソースから画像処理にも使用できます。etc.)、DV カメラ、ウェブカメラと WIA と互換性のあるイメージング デバイス。 システムのセットアップ 動き追跡ソフトウェアのインストール キーを USB 2.0 ポートに差し込み、インストール ツールを起動します。 実験的領域の上カメラを修正し、それ実験の期間の間不動が保たれることを確認します。 取扱説明書を使用して運動追跡ソフトウェア システムに新しい実験を設定します。新しい実験を選択します。プロトコルのアイコンをダブルクリックして、新しい実験する必要があります (図 3、補助ファイル 1) に従うこと。 ラベル/実験情報ダイアログで実験を説明する詳細を入力します。 ビデオ シーケンスを処理するためのソースを指定します。 正しい距離測定の変換規則を定義します。校正プロセスには、距離と速度の信頼性の高い値を得るために実験の領域の実際の寸法を通知する運動追跡ソフトウェアができます。 作業領域への関心 (ゾーン) の領域を決定します。 検出プロセスのパラメーターを調整します。 動き追跡ソフトウェア イメージの動物の位置を正確に検出するため、いくつかの検出調整を設定する必要があります。 追跡プロセスでは、検出の設定パネルの明るさとコントラストのセクションで一般的な明るさとコントラストのパラメーターの微調整を使用してはっきりとよく対照的なイメージが必要です。必要に応じて、画像全体またはユーザー定義のゾーンにこれらの設定を調整します。 検出プロセスをテストする各アリーナにネズミを入れてください。 検出プロセスが正しく対象を識別できるかどうかを確認するテストの開始ボタンを押します。検出をアクティブに画面上のドットの外観を確認します。校正プロセスは、テストを開始する前に行う必要があります。 検出は、プレーヤーで表示される唯一の黒いドットが追跡されている動物を確認とみなされます。トラッキング線赤は密接にすべての動物の変位に従う必要があります。適切な追跡はまた座標の変位に基づく動物番号のリストと対応するホワイト ラベル確認します。そのような検出が得られない場合は、検出の最適化およびプロセスを追跡するためのしきい値とびらんのパラメーターを調整します。 シャープとノイズのないテスト画像を得るためのしきい値と侵食のパラメーターを調整します。 トラッキング パスは正しく表示されない場合は、テストの停止ボタン (図 4) を押します。これらの調整は、実験の新しいファイルすべてに使用する場合は、[既定値として保存] ボタンを押します。新しい検出設定を保存に同意ボタンを押します。 試験の時の条件を設定します。 実験プロトコルは、実験エリアに配置された対象は同じ時間に開始するトラックの取得プロセスを必要とする場合ソフトウェアに付属しているリモート ユニットを設定するか、ワイヤレス マウスを使用することが可能です。注: このオプションは、リモート開始と停止を制御する可能性を提供します。 システムでは、被験者のセットアップ 実験対象のデータベースを管理します。実験科目のデータベースを作成するには、実験アシスタントのバーの科目のボタンを押すと被験者データベースマネージャーを入力します。 データベースに新しい科目を追加するボタンを押して+ 。 1 つの対象オプションを既に選択、対象のコードを入力します。 件名プロパティ] セクションの件名の情報の残りの部分を入力します。 新しいテーマを追加するのに [作成] ボタンを押します。 実験計画を定義します。スケジューラを使用してさまざまなフェーズを定義します、セッション、試験、および被験者実験プロジェクト内で実行される予定です。裁判が「次の試行」として自動的に選択されます。このプロパティは、試用版の名前の左側にある緑色のチェック マークで表示されます。 同時録音と追跡によるデータ収集注意: ライブ イメージ ソースが選択されているときは、プレーヤーパネルは簡単に選択したカメラからビデオをキャプチャするため埋め込み録音モジュールを提供します。 データ集録 (校正、ゾーン定義、検出設定、時間設定、スケジューラ) の運動追跡ソフトウェアを準備します。 データ集録のパネルを開きます。 せず、動物実験のソフトウェアで利用可能な記録を開始] ボタンを押して録画を開始します。 動物を実験のエリアに配置します。 時間コントロールパネルの開始ボタンを押すとデータ取得プロセスを開始します。追跡プロセスが実施される記録プロセスと同時。必要に応じて、行動の変数を手動で書き留めること実験者を求める後部など頭ディップと滝 (図 5)。 EPM データを収集手動でと同様、実験室で盲目のオブザーバー (カーテンで EPM からオブザーバーは別)。 追跡処理記録の終わりまで待つか時間制御パネルの停止ボタンを押します。 実験区域から動物を削除します。動き追跡ソフトウェア プレーヤーで使用可能な停止ボタンを押すとビデオ録画プロセスを停止します。 洗浄、乾燥させると次の動物の実験エリアを準備します。再び同じサイクルを繰り返します。 データ分析 分析ツールにアクセスするには、実験アシスタントのバーの分析ボタンを押します。 終了試験の分析レポートを生成するため、分析試験を選択します。構成、分析レポートを選択します。分析する時間間隔を設定します。生成し、レポートを確認します。結果をスプレッドシートまたはイメージ形式 (図 6) にエクスポートします。 不安レベルの測定のための EPM 経口後 (ぼんやり点灯と静かな部屋) でノンストレス条件下で EPM 実験を実行します。注: 概日リズムは EPM15,17の齧歯動物の行動に影響を及ぼすために、実験がクローズ時間間隔 (例えば1200 と 1400 との間) で実行されることを確認します。実験中に不必要な動きやノイズを避けるため。 テストの開始前に、EPM を洗浄して乾燥し、追跡システム ビデオを使用する準備を確認します。 自分のホームのケージでラットを実験室の実験を開始する前に 30 分に転送します。 EPM は、実験者の反対の腕が開いてに直面しての 4 つの腕の交差にラットを配置します。 トラッキング ソフトウェア、ビデオの実行だけでなく、5 分のための動物の動作を手動で記録。 動物 EPM が落ちる場合は、それを拾うし、それが落ちた、EPM の同じポイントに戻る場所します。この動物の行動データを分析から除外します。注: 大きな音や動きが固定/凍結開いて腕上の動物。実験中に大きな音は聞いたことが場合、は、分析からその時点で実験動物の行動データを除外します。 5 分テストの終わりに、トラッキング ソフトウェア ビデオを停止し、EPM から動物を削除します。その家のケージに戻ってそれを配置します。 次の実験/動物前に水道水に続いて消毒洗剤 (例えばQuatricide) で EPM をクリーンアップします。ペーパー タオルで器具を乾燥させます。 4. ビデオ追跡システムによって収集されたデータの解析 開いて腕の中で、閉鎖の腕の中に費やされた時間数を分析記録されたデータに基づいて、腕にオープン、クローズドの腕と、センター ゾーンに作成されたエントリの数遅延; 閉じた腕の中にエントリを腕にオープン、クローズドの腕およびセンター ゾーンで進む距離。注: 動物である区域にあるとき中心体の質量は、その地域では。 テスト/テューキーの多重比較検定、フィッシャーの最小有意差 (LSD) 分散分析 (ANOVA) を用いた処理動作に及ぼす影響を決定します。