Um protocolo de preferência condicionada lugar para medir a incubação do desejo em ratos
Summary
Aqui, um protocolo de preferência (CPP) do lugar de morfina condicionado é descrito para medir a incubação do desejo em ratos.
Abstract
Das principais causas de repetidas recaídas é um desejo pela droga. Drogas desejo aumenta progressivamente durante o período de abstinência, um fenômeno denominado incubação da ânsia da droga. Aqui, descrevemos um protocolo de preferência (CPP) do lugar de morfina condicionado para medir a incubação do desejo em ratos. Neste protocolo, um paradigma CPP, empregando principalmente sugestões somatossensorial é usado para estabelecer uma memória de recompensa a longo prazo de morfina. Uma caixa CPP de três-câmara que difere a textura do chão da câmara é construída. Em primeiro lugar, os animais são testados para sua preferência de linha de base para as câmaras de dois lado por três dias consecutivos. Então, eles são injectados intraperitonealmente com morfina/soro fisiológico e colocados na sua câmara não-preferenciais/preferenciais por 45 min. Depois de 6 dias de condicionamento, sua preferência para as câmaras de lado é testada por 15 min em pontos diferentes de tempo após a última sessão de condicionamento. Com este paradigma, a memória de recompensa de morfina pode durar pelo menos 18 dias. Para testar se o protocolo acima mencionado pode modelar o desejo maior, o número de entradas em câmaras de dois lado é contado durante o período de abstinência. Os resultados mostram que as entradas aumentaram, sugerindo que o paradigma do CPP poderia imitar a incubação de desejo. Estudos futuros podem empregar este modelo para estudar os mecanismos neurais subjacentes a memória de longo prazo e incubação de desejo.
Introduction
Da toxicodependência é uma doença crônica1 com vários estágios diferentes2: compulsão/intoxicação, retirada/negativo afetam e preocupação/antecipação. Na fase inicial de compulsão/intoxicação do ciclo de dependência de drogas, temas tomar drogas devido ao efeito reforço2. Na fase de afeto negativo/retirada, temas experimentam somáticos e emocionais Estados negativos de abstinência de drogas, que promovem os mecanismos de reforço negativo associados ao desenvolvimento de dependência3. Na fase de preocupação/antecipação, assuntos reintegrá-drogas-buscando após a extinção, que pode ser desencadeada por drogas associadas sugestões ou estressores. Em estudos com animais da toxicodependência, lugar condicionado paradigmas de preferência (CPP) são usadas para imitar o efeito de reforço positivo de drogas4,5,6 , e, assim, é usado para modelar a fase inicial da droga ciclo de dependência. Morfina, um membro da família de opioide, produz um efeito de reforço positivo, ativando os receptores opioides no cérebro7,8.
O paradigma do CPP é baseado no princípio da clássica (pavloviano) condicionado e comumente usado para medir o efeito gratificante de drogas de abuso, tais como morfina4,5,9,10, devido a sua fácil disponibilidade em laboratórios. Um paradigma CPP típico consiste de três fases: pré-condicionamento, condicionamento e teste de fases. Durante a fase de condicionamento, as propriedades gratificantes de uma droga (estímulo unconditioned) são combinadas com um ou mais neutros contextuais estímulos, que ganham Propriedades gratificantes após vários pares de condicionamento e servem como estímulos condicionados. Durante a fase de teste, preferência dos animais para drogas-emparelhado compartimentos são medidos e refletidas como sua memória de recompensa. Por esta razão, o paradigma do CPP também é usado para investigar os mecanismos de aprendizagem e memória. Para estabelecer uma memória de recompensa a longo prazo de morfina, variáveis que afetam o estabelecimento do CPP foram ajustadas e otimizadas com o abaixo descrito protocolo11. Estímulos contextuais são uma combinação de visual, tátil e pistas de odor. Variações de estímulos contextuais e pontos de tempo de testes são feitas de acordo com fins de investigação diferentes. Por exemplo em nosso estudo anterior12, as pistas somatossensorial (texturas de piso diferente) foram usadas principalmente como estímulos contextuais para investigar o papel da parte caudal do córtex insular, uma região do cérebro com função somatossensorial, na aquisição e manutenção da memória de recompensa a longo prazo. O design do aparelho e a atribuição de ratos para os lados preferido/não-preferenciais afetam o estabelecimento do CPP. Um aparelho de três-câmara em vez de um aparelho de duas câmaras é usado na abaixo protocolo para evitar escolhas forçadas. O saldo de duas câmaras de lado e a atribuição inicial de animais neles afetam a aquisição da CPP4,13. Assim, um design equilibrado das câmaras de lado e atribuição tendenciosa dos animais são aplicados neste protocolo para adquirir uma local com forte preferência. Manutenção da memória de recompensa a longo prazo requer mais condicionado testes durante a fase de condicionamento. Para reduzir o custo de tempo durante a fase de condicionamento, são realizados dois ensaios condicionado por dia e injeções de morfina/solução salina são contrabalançadas para evitar o efeito de abstinência aguda de morfina na salina ensaios emparelhados4.
Reintegração de modelos animais14 foram estabelecidos para modelar a fase de preocupação/antecipação do ciclo de dependência de drogas. CPP é também utilizada para estudar o restabelecimento que modela a recaída de comportamento viciante5. Recaída é uma das barreiras no tratamento da dependência de drogas. Desejo é uma causa de recaída repetida. O desejo por drogas aumenta constantemente durante o período de abstinência, um fenômeno denominado incubação da ânsia de15,16. Incubação de desejo é amplamente estudada no paradigma de auto-administração de drogas, mas não o paradigma do CPP. O uso do paradigma CPP para refletir a incubação do desejo foi primeira proposto por Li et al 17. seus resultados17 mostraram que as pontuações CPP de baixas doses de morfina (1 mg/kg e 3 mg/kg), mas não uma dose elevada (10 mg/kg) aumentadas progressivamente durante os primeiros 14 dias de abstinência. Da mesma forma, ratos injetaram com uma dose baixa de cocaína mostrou aumentada partituras CPP ao longo do tempo18. O golo de CPP aumento das baixas doses de morfina foram usados para refletir o desejo incubadas17. Duração passou em tanto número de entradas no ambiente associada a drogas é sugerido para refletir as respostas condicionados reforçadas o paradigma CPP19. A maioria dos estudos recentes usa escores CPP directa ou indirectamente refletir o tempo gasto nas câmaras de droga-emparelhado, enquanto o número de entradas para os aposentos de lado como um parâmetro é muitas vezes negligenciado. Por estas razões, utilizou-se uma dose de morfina 10 mg/kg e o número de entradas foi medido em nosso estudo11. Os resultados mostram que as entradas de ratos para as câmaras de lado aumentaram significativamente durante o período de abstinência11. Isso indica que ambos os escores do CPP e número de entradas são parâmetros úteis na avaliação maior desejo por drogas e o paradigma do CPP é aplicável para modelar a incubação do fenômeno o desejo. No entanto, para reduzir o número de animais necessários, um grupo de animais experientes morfina é testado repetidamente; assim, não se pode excluir o efeito de extinção com a corrente dentro do projeto assunto. A entre projeto do assunto com o mesmo protocolo pode superar essa limitação.
A seguir descreve o protocolo do CPP que estabeleceu a longo prazo memória de recompensa e modelado desejo aumentado. Brevemente, após três dias de pré-condicionamento, ratos passam seis dias de condicionamento com dois ensaios condicionado por dia e em seguida são testados em pontos diferentes de tempo após o último julgamento de condicionamento. Neste paradigma de CPP, uma caixa de três-câmara de cloreto de polivinila (PVC), usada como o aparelho CPP é construída e o assoalho do aparelho é equilibrado. O aparelho consiste de duas câmaras de lado preto grande (30 cm × 25 cm × 30 cm, L × W × H) e um média branca câmara (11 cm × 25 cm × 30 cm, L × W × H) com piso de PVC branco liso. As câmaras do dois lado têm piso diferentes texturas como pistas somatossensorial: um com um piso de plexiglass de grade, o outro com um áspero piso de PVC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, um método usando um paradigma CPP de morfina é descrito para estabelecer memória de recompensa a longo prazo em ratos com sugestões somatossensorial como contexto condicionado. Para construir uma memória recompensa a longo prazo, um protocolo anterior21 com um aparelho equilibrado do CPP é modificado e as sessões de solução salina e morfina são conjunto de pelo menos 10 h separados. Além disso, mais sessões de condicionamento são adicionadas durante a fase de condicionamento para melhorar a aprendizagem associativa. Aparte o golo de CPP, medem-se as entradas de duas câmaras de lado e o padrão de aumento entradas para os aposentos do lado é semelhante com a das aumentada respostas ativas no paradigma da auto-administração.
Diversos fatores influenciam o estabelecimento do paradigma CPP mencionado acima. Um fator chave é o design do aparelho: ratos em geral devem ter preferência semelhante para ambas as câmaras do lado para garantir que o aparelho está equilibrado. Um aparato desequilibrado pode mascarar a aquisição do CPP, devido à preferência de alta inicial de um lado câmara13. Portanto, preferência extrema para uma câmara lateral (mais de 90% do tempo total em qualquer das câmaras do dois lado) deve ser evitada quando escolher a textura do chão ou outras pistas contextuais. Para diferentes fins experimentais, experimentadores podem equilibrar o aparato CPP, modificando o estímulo contextual. Para aparelho equilibrado, duas formas de delineamento experimental são comumente usados4. Uma forma tendenciosa é drogas de par com a câmara não-preferenciais com todas as disciplinas; uma maneira imparcial é emparelhar metade dos animais com drogas na câmara não-preferenciais, a outra metade com a câmara de preferencial. Os dois lados podem estabelecer CPP13 mas estudos17,25 , com o último design sempre excluir muitos assuntos devido a sua forte preferência para a câmara de um lado. Como existe uma vulnerabilidade individual para28 27,26,do vício em drogas, um projeto tendencioso foi escolhido neste estudo para evitar a exclusão de indivíduos saudáveis. Uma limitação de design tendencioso é o efeito de preferência inconsistente para câmaras de lado. Como mostrado na Figura 2, ratos no grupo salino tem consistente baixos escores CPP para a câmara inicial de não-preferenciais. Assim, a possibilidade que inconsistente preferência aos aposentos do lado poderia afetar as pontuações CPP no grupo morfina é excluída definindo os controles salinos. Para evitar o efeito de teto da câmara preferencial, usamos a câmara inicial não-preferenciais como câmara emparelhados de morfina. Para evitar o efeito de novidade e estresse sobre a preferência de linha de base para os aposentos de lado, são realizadas três sessões de pré-condicionamento, e a terceira sessão é usada como linha de base. O quarto fator é o intervalo entre sessões Salinas e morfina. No nossa paradigma, nós escolhemos a intervalos de pelo menos 10 horas para evitar o efeito de abstinência no período condicionado salina. A dosagem de morfina é também um factor importante. Extremamente baixas doses de morfina, tais como 0,01 mg/kg6, não induzir a preferência de lugar. Uma dose de 10 mg/kg induzida maior pontuação CPP17 em ratos e é comumente usada no rato morfina CPP estudos17,21,23. No entanto, morfina 10 mg/kg (i.p.) pode induzir depressão respiratória em cerca de 5% dos ratos. Doses mais baixas de morfina, tais como 5 mg/kg, podem ser usados em estudos futuros. Para outras espécies, como árvore musaranho, tolerância às drogas deve ser considerada ao criar o paradigma do CPP. Desde que a árvore musaranho desenvolve rápida tolerância à morfina, aumento de doses de morfina devem ser usados durante o condicionamento fase29,30.
Com o protocolo modificado, uma memória de recompensa a longo prazo é estabelecida pelo menos 18 dias após 6 dias de condicionamento11 (Figura 2). Estudos futuros devem medir se CPP poderia ser mantida por mais tempo. Repetidas de recaída é a maior barreira no tratamento da toxicodependência. Estresse, Dicas ambientais e drogas podem induzir a recaída. Após a extinção da memória CPP, este modelo pode ser usado para modelar a recaída induzida por estresse ou drogas.
As entradas para as câmaras de droga-emparelhado no grupo morfina aumentaram na abstinência período11 (Figura 3), que é semelhante com as mais ativas respostas no paradigma da auto-administração. Entradas para a câmara de solução salina-emparelhado também aumentaram com o paradigma CPP em ambos os ratos e musaranhos árvore11, que é diferente de respostas inativas do paradigma da auto-administração. Esta diferença talvez devido aos diferentes princípios básicos dos dois paradigmas: um é o condicionamento clássico, o outro é o condicionamento operante. Além disso, árvore shrews com comida que cpp experiências não mostrou tal padrão de aumento de entradas de30. Portanto, as entradas aumentada de ambas as câmaras do lado em morfina-experiente animais são pensadas para representar incubada ânsia de drogas. Embora a limitação do uso de medidas repetidas em um assunto não pode ser excluída, o padrão de aumento entradas foi conservado em ratos11, árvore shrews11,30 e macacos31. No entanto, um período entre projeto do assunto durante a abstinência é altamente recomendado para estudos futuros excluir o efeito de extinção de medições repetidas.
Além das entradas de aumentada, golo de CPP com baixas doses de morfina (1 mg/kg e 3 mg/kg) aumentou progressivamente durante o período de abstinência17. Estes resultados sugerem que o paradigma do CPP também poderia modelar a incubação do fenômeno o desejo. No entanto, uma maior pontuação do CPP também pode representar uma aumento de memória para o estímulo condicionado. Neste aspecto, as entradas para as câmaras de lado em um aparelho de três-câmara, que são semelhantes às respostas ativas no paradigma da auto-administração, mais se assemelham a busca de drogas ou o gratificante efeito de drogas. Seria interessante verificar as tendências das entradas para os aposentos de lado durante o período de abstinência em paradigmas CPP de rato de menores doses de morfina. Futuros estudos com outras drogas e ratos devem ser feitos para verificar se este fenómeno é conservado através de drogas de abuso e as espécies.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela nacional ciências naturais Fundação de China (NSFC) 31741058 (Y.Z.), subvenções governamentais Shenzhen (JCYJ20170818162613877 e JCYJ20170818163217196) e China Postdoctoral Science Foundation Grant 2017 M 622826 (K.Z.).
Materials
| Morphine | Shenyang First Pharmaceutical Factory | ||
| CPP apparatus/Camera | Anlai Technology Company | ||
| SPSS | IBM Inc |
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