Индивидуальные культивирования копепод Tigriopus и количественного анализа их поведения, мате охрана
Summary
Мате охрана поведение играет важную роль в воспроизводстве приливной копепод рода Tigriopus. Однако не были хорошо описаны методы для изучения этого поведения. Здесь мы описываем методы: 1) отдельные культуры девственной Tigriopus животных, и 2) количественный анализ их поведения, мате охрана.
Abstract
Копепод род Tigriopus, которые являются общей зоопланктона в скалистых прилива бассейны, показать precopulatory Мате охрана поведение, где мужчина замочки потенциального партнера сформировать пару. Хотя это явление вызвало интерес исследователей, методы для его анализа не были хорошо описаны. Здесь мы описываем процедуры: 1) индивидуальных культивирования и постановка Tigriopus несовершеннолетних и взрослых и 2) видео на основе анализа их поведения, мате охрана. Метод культивирования позволяет экспериментальный контроль кожура опыт животных, а также возможность отслеживать их развития до поведенческие тесты. Метод анализа позволяет дать количественную оценку некоторых аспектов поведения Мате охрана, включая захват попытки мужчины и плавание траектории Мате охрана пар. Хотя эти методы были первоначально созданы для этологии исследования на Tigriopus, с надлежащей модификации они могут также применяться для исследования других зоопланктона в различных исследовательских областях, таких как физиологии, токсикологии и экологические генетика.
Introduction
Дезовые приливные копепод рода Tigriopus широко распространены в скалистых высоких приливных бассейнов через несколько континентов1. Эти копепод демонстрируют поведение, мате охрана в рамках их размножения, когда взрослый мужчина захватывает потенциального партнера (несовершеннолетних или взрослых) используя его подключили первые антенн до совокупления (рис.1 и рис.2)2 ,3,4,5. Хотя это явление является предметом этологии и биохимических исследований для десятилетий2,3,6,7, подробные процедуры для исследования этого поведения, в том числе Индивидуальные культуры девственной животных и критерии поведения событий видели в Мате охрана попытки, не были хорошо описаны. Таким образом здесь мы разработать методы, позволяющие исследования поведения под контролируемой экспериментальной среде.
Индивидуальные культивирования и постановка животных
Предыдущие исследования размножения Tigriopus условно заняты пару отсоединение метод для подготовки несовершеннолетних (copepodids) и взрослых самок поведенческие тесты и разведение эксперименты3,8,9 ,10. Однако этот метод позволяет животных форма пар и потенциально совокупляться до испытаний (обсуждается в 1988 году Ито11), которые могут изменить поведенческие свойства животных5. Кроме того есть потенциал, чтобы недооценивать этапы развития копепод с обычными протоколами, как они полагаются на размер очевидной тела для постановки. В настоящем документе мы описываем индивидуальный метод культивирования в нашем недавнем исследовании с Tigriopus californicus5, который был разработан для устранения этих недостатков, управляя спаривания опыт животных и отслеживание их развития от copepodid до стадии взрослого.
Количественный анализ поведения, мате охрана
Исследовано поведение Мате охрана видов Tigriopus не только в области этологии2,6 , но и в других областях, таких как экотоксикология и эволюционной генетики3,4, 7 , 8 , 9 , 10. Однако, предыдущие исследования объяснили курс этого поведения в основном письменные формы без достаточного визуальных иллюстраций изложить как поведение, так и методы для его изучения, которые создает технических препятствий для Репликация и продвижение исследований. Здесь мы предоставляем подробные описания некоторых из ключевых событий в Мате охрана поведение Tigriopus копепод, поддерживаемых визуальные материалы. Мы также продемонстрировать оборудование и методы для количественного анализа поведения. Эти методы позволяют оценки поведенческих свойств животных во время попытки Мате охрана в точно реплицированных экспериментов.
С помощью этих методов мы стремимся предоставить методологические основы исследования контролируемого и воспроизводимые на Мате охрана поведение род Tigriopus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Индивидуальные культивирования и определение стадии и секс
Здесь мы описал метод, используемый в наших предыдущих исследований5 подготовить девственной Tigriopus животных с их спаривания опыт, контролируемых отслеживая их развития (рис. 4 и рис. 7). Как Tigriopus видов используются как модель животных в различных областях биологических например токсикологии16,18, экологическая физиология19,20,21и эволюционный Генетика13,,2223,24, этот метод имеет возможность предоставлять ценные средства для оценки воздействия экологических и генетических факторов на жизненный цикл этих рачков.
Для достижения успешной постановки, обычный поиск и сбор CI copepodids от массовой культуры (шаг 1.2) имеет решающее значение, как коллекции на более поздних этапах может привести к неправильной постановке животных. Кроме того тщательный поиск exuviae (шаг 1.3) также имеет важное значение для точной постановки. Увеличьте частоту сбора и проведение по мере необходимости, как интервал между линяет варьируется от одного до нескольких дней в зависимости от видов и воспитания условие2,25,26. Различия в морфологии антенн copepodids и взрослых самок не заметно значительное в некоторых видов и популяций Tigriopus16,25. Следовательно постановка перед sexing полезно различать взрослых самок от передовых copepodids обоего пола.
Поведенческие тесты и ручной анализ поведенческих свойств
В целом одним из наиболее важных частей этологическая исследований является определение и описание событий, представляющих интерес. Методы, представленные в настоящем документе были впервые разработаны для нашего недавнего исследования5 и дополнено описанием совокупление и наглядных пособий (Рисунок 10). В дополнение к этому последовательность в животных обработки также играет важную роль в поведенческих экспериментов. Например промывки копепод потенциально может облегчить некоторые аспекты их поведения (дополнительная цифра 1) и поэтому желательно, чтобы выполняться последовательным образом среди образцов, таких, как стандартизированные в шаге 2.1.3. Мы ожидаем, что материалы, представленные в настоящем документе будет помогать контролируемых и воспроизводимости исследований на Мате охрана поведение Tigriopus, поощрение репродуктивного и экологические исследования этот богатый житель прилива бассейны.
Одно из возможных ограничений с помощью этого метода является малое увеличение полученных изображений. Хотя фильмы, записанные с нашей системой позволяют идентифицировать выдающихся тела структур, включая urosomes и мужской первый антенн, одно не сможет наблюдать более тонкие структуры, такие как ноги и гениталии с нашим методом, так как он не использовать микроскопические увеличение для записи видео. Хотя Келли et al. сообщили, что они были в состоянии соблюдать сперматофоры передачи от мужчины женщины т. japonicus под микроскопические наблюдения на 100 крат (не видео)7, мы не смогли наблюдать сперматофор в наших фильмов, возможно из-за ограничения разрешения изображения.
Двумерные отслеживания пар
Хотя этот метод не позволяет трехмерного отслеживания животных, он позволяет анализ двумерных траектории зоопланктона без химически маркировки животных (cf. Сало et al. 201027), используя программы распространяется бесплатно. Если размер файла фильма является слишком большим, чтобы быть обработаны в ImageJ, можно уменьшить разрешение файла и преобразовать его в фильм серой шкалы. В то время как описан метод первоначально был разработан для взрослых пар т. californicus (рис. 12 и рис. 13), также доступна для взрослых несовершеннолетних пар и отдельных лиц (дополнительная цифра 1) как а также других видов Tigriopus , в принципе. Мы ожидаем дальнейшего метод, чтобы быть применимым к краткосрочной (от миллисекунд до второй шкалы времени) траектории анализ зоопланктона других таксонов с соответствующими изменениями.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается за счет субсидий Фонда, Япония Sumitomo (Грант для основных научно-исследовательских проектов, номер гранта: 150932) и исследовательский институт морских беспозвоночных, Япония (2018 Индивидуальный исследовательский грант) ИППП и RSB и Грант из США Национальный научный фонд (DEB-1556466) к РСБ. Мы благодарим г-жа Киана Мишель Woodward для обратной связи на метод культивирования и промежуточной.
Materials
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
| PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
| Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
| Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
| Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
| LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
| Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
| P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
| ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
| MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |
References
- Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus. Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).
- Fraser, J. H. The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).
- Burton, R. S. Mating system of the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 86 (3), 247-252 (1985).
- Lazzaretto, I., Salvato, B., Libertini, A. Evidence of chemical signaling in Tigriopus fulvus (copepoda, harpacticoida). Crustaceana. 59 (2), 171-179 (1990).
- Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Sex-specific rejection in mate-guarding pair formation in the intertidal copepod, Tigriopus californicus. PLoS ONE. 12 (8), e0183758 (2017).
- Ito, T. The biology of a harpacticoid copepod, Tigriopus japonicus Mori. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Series 4, Zoology. 17 (3), 474-500 (1970).
- Kelly, L. S., Snell, T. W., Lonsdale, D. J. Chemical communication during mating of the harpacticoid Tigriopus japonicus. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 353 (1369), 737-744 (1998).
- Kelly, L. S., Snell, T. W. Role of surface glycoproteins in mate-guarding of the marine harpacticoid Tigriopus japonicus. Marine Biology. 130 (4), 605-612 (1998).
- Peterson, D. L., et al. Reproductive and phylogenetic divergence of tidepool copepod populations across a narrow geographical boundary in Baja California. Journal of Biogeography. 40 (9), 1664-1675 (2013).
- Palmer, C. A., Edmands, S. Mate choice in the face of both inbreeding and outbreeding depression in the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 136 (4), 693-698 (2000).
- Ito, T. Taxonomy within the genus Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida) from Japan, with reference to the relationship between Tigriopus japonicus and T. californicus. Annual report of the Seto Marine Biological Laboratory. 2, 28-35 (1988).
- Barreto, F. S., Schoville, S. D., Burton, R. S. Reverse genetics in the tide pool: Knock-down of target gene expression via RNA interference in the copepod Tigriopus californicus. Molecular Ecology Resources. 15 (4), 868-879 (2015).
- Pereira, R. J., Barreto, F. S., Pierce, N. T., Carneiro, M., Burton, R. S. Transcriptome-wide patterns of divergence during allopatric evolution. Molecular Ecology. 25 (7), 1478-1493 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Raisuddin, S., Kwok, K. W., Leung, K. M., Schlenk, D., Lee, J. S. The copepod Tigriopus: a promising marine model organism for ecotoxicology and environmental genomics. Aquatic Toxicology. 83 (3), 161-173 (2007).
- Lazzaretto, I., Franco, F., Battaglia, B. Reproductive behaviour in the harpacticoid copepod Tigriopus fulvus. Hydrobiologia. 292, 229-234 (1994).
- Medina, M. H., Morandi, B., Correa, J. A. Copper effects in the copepod Tigriopus angulatus Lang. Marine and Freshwater Research. 59 (12), 1061-1066 (1933).
- McDonough, P. M., Stiffler, D. F. Sodium regulation in the tidepool copepod Tigriopus californicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 69 (2), 273-277 (1981).
- Hagiwara, A., Lee, C. -. S., Shiraishi, D. J. Some reproductive characteristics of the broods of the harpacticoid copepod Tigriopus japonicus cultured in different salinities. Fisheries Science. 61 (4), 618-622 (1995).
- Pereira, R. J., Sasaki, M. C., Burton, R. S. Adaptation to a latitudinal thermal gradient within a widespread copepod species: the contributions of genetic divergence and phenotypic plasticity. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284 (1853), 20170236 (2017).
- Barreto, F. S., Pereira, R. J., Burton, R. S. Hybrid dysfunction and physiological compensation in gene expression. Molecular Biology and Evolution. 32 (3), 613-622 (2015).
- Alexander, H. J., Richardson, J. M., Edmands, S., Anholt, B. R. Sex without sex chromosomes: genetic architecture of multiple loci independently segregating to determine sex ratios in the copepod Tigriopus californicus. Journal of Evolutionary Biology. 28 (12), 2196-2207 (2015).
- Foley, B. R., Rose, C. G., Rundle, D. E., Leong, W., Edmands, S. Postzygotic isolation involves strong mitochondrial and sex-specific effects in Tigriopus californicus, a species lacking heteromorphic sex chromosomes. Heredity. 111 (5), 391-401 (2013).
- Koga, F. On the Life History of Tigriopus japonicus Mori (Copepoda). Journal of Oceanography. 26 (1), 11-21 (1970).
- Powlik, J. J. Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78 (2), 467-481 (1998).
- Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. Tracking the small with the smallest – Using nanotechnology in tracking zooplankton. PLoS ONE. 5 (10), e13516 (2010).
