Tigriopusカイアシ類と仲間を守る行動の定量分析の個別培養

1 原生動物の行動観察のための準備 受精卵を入手して孵化するようにします。 妊娠女性のパスツール ピペット株式文化からクリア オレンジ (すなわち、受精と開発の先進的な段階で) 卵 (図 3) を運ぶを収集します。優しく文化で孵化したことがあります nauplial の幼虫を含む他の動物の転送を避けるためにクリーンな培地のそれらをピペッティングにより女性をすすいでください。注: このプロトコルで 35% の塩分濃度と人工海水は培養培地として使用されます。実験の目的に応じて異なる媒体 (例えば人工海水塩分濃度が高いと追加の溶質) を使用します。注: は、バレットら2015年12実験室培養株の確立のための法とペレイラら201613 t. ミヤコカブリダニの自然個体群のコレクション サイトの例を参照してください。ピーターソンらは、緯度と経度の情報9 t. ジャポニカス t. fulvus、 t. ミヤコカブリダニのコレクション サイトをまた報告しました。約 30-50 mL の容量を持つプラスチック製のピペットを使用して、岩のプールからTigriopusカイアシ類を収集します。 きれいな培地 (図 4左) と 6 も細胞培養プレートのウェルに個別に各女性を配置します。他の動物 (nauplial の幼虫を含む) は井戸を汚染しないことを確認します。 文化女性の卵の嚢がリリースされるまでに 12 時間の明暗周期を 20 ° c 設定インキュベーターでプレートを維持します。この手順は、通常種と胚の発達段階に応じて 1 ~ 10 日をかかります。一方、各妊娠女性細かく地面 (約 < 0.5 mm 径) 魚料理の 2 つの穀物との週 2 回フィード (詳細については材料の表を参照してください)。注: は、異なる温度及び実験の目的に応じて光のサイクルを使用します。高い温度は、胚のより急速な発展を促進できます。注: は、井戸における腐食の余分な食品を放置しないでください。食べ物のかすは崩壊を開始する場合、井戸からパスツール ピペット ピペットします。 卵嚢が解放された後、パスツール ピペット文化井戸から女性を削除します。注: 受精女性子孫2,3の複数のクラッチを産卵が可能です。必要な場合は、さらにクラッチを収集するために他の井戸に女性を転送します。 個々 の文化のための copepodids を収集します。 インキュベーターで孵化した給餌でプレートを保つ、彼らは最初のコペポタイド (CI) ステージ (図 4中間) の開発まで、給餌の文化します。この手順は、通常 1 ~ 2 週間かかります。細挽きのいくつかの穀物とも各飼料食品を 2 日に 1 回 CI 動物を捜している間魚。蒸留水の蒸発の飼育水を補充します。注: 場合は浮かんでいる残骸は、ビューを妨げ、ペーパー タオルの小さい部分でそれをなぞる。 CI の動物が登場し始め、すぐには約 8 μ L、10 X 40 X 倍率 (図 4右) に実体顕微鏡下で設定の分注量 P-10 マイクロ ピペットで井戸から収集します。優しくきれいな人工海水でピペッティングによる各 CI 動物を洗うし、人工海水の 2-3 mm 深さ (約 400-600 μ L) を含む 24 ウェルの細胞培養プレートのウェルに配置。注: を避ける nauplial のぬけがらや個々 のカルチャの井戸に他の動物の上に運ぶ。 脱皮のぬけがらをカウントすることによって、個人の開発を追跡します。 (必要に応じて周波数を調整する) すべての 2 〜 3 日脱皮ぬけがらの各ウェル中 10 X 40 X 倍率で暗視野照明下での表面観察して調べる。透明な copepodids のぬけがらは、直立させた足、尾側枝 (すなわち、薄い尾側端構造の突出)、および/または prosome と urosome (図 5) の分割のペアと認識できます。フォーカスとよく (図 6 a) で異なる深さにぬけがらを検出する照明を変更します。注: 脱皮ぬけがら、それら脱皮動物よりも小さくなります。古いの (すなわちより小さい) のぬけがらには高い倍率に動物と比較的最近のぬけがらシフトの低倍率から審査を開始します。注: 井戸のぬけがらが破損した場合発達段階に対する誤判断を避けるためにさらに発達追跡から井戸を排除します。注: 場合は浮かんでいる残骸は、ビュー (図 6 b) を阻害、ペーパー タオルの小さい部分でそれをなぞる。 プレート蓋 (図 7) にタリー印の各ウェルにコペポタイドぬけがらの総数を記録します。新しいぬけがらは井戸を発見、マークに線を追加します。注: 場合は井戸の汚染された nauplial のぬけがら、カウントからそれらを排除します。 2 粒細挽きの各個人を養う魚の食品。塩分濃度を維持するために蒸留水と蒸着の飼育水を補充します。注: フィード copepodids のすべての 2 〜 3 日を消費し、脱皮のぬけがらは、潜在的 (ステップ 1.3.4) の発達段階の推定に影響を与えることができる損傷からそれらを防ぐために。 ぬけがらの数に基づいて動物の発達段階を推定します。ぬけがらはありませんが、個人が CI の段階で推定されます。1 ~ 4 のぬけがらなら、個人は CV の段階に CII でと推定されます。5 ぬけがらなら、個人が大人になると推定されます。 形態に基づく大人のセックスを識別します。 その形態を調べることによって動物のセックス。Tigriopusの成人男性では、遠位端 (図 3 a) フックと球状の構造を持つ膝の最初アンテナを所有しています。成人女性では、男性のものよりも、(図 3 b) 滑らかな、比較的薄く最初レベルのアンテナを所有しています。一部の女性も自分の体 (図 3 b, 3 D) の生殖腺の脂質から深緑色を示します。 よく (図 7 b) の蓋のセックスをマークします。 2. 行動テストと仲間を守る行動のビデオ録画 テストの日に必要なステージと行動テストのためのセックスの動物を選択します。 細かく地上魚食糧文化井戸で選択した個人をフィードし、30 分のそれを食べることができます。一方、テスト室を準備する 2.1.2 のステップへ進みます。 テスト室; として 2 つ 48 ウェル平底細胞培養皿を準備します。(以下、「プレート A」と呼ばれる) 1 つのプレートは男性、その他 (「プレート B」) は、ターゲット (例えばcopepodids、成人女性、成人男性)。プレートの井戸で 35% の塩分濃度ときれいな人工海水の 400 μ L を追加します。光を拡散 (図 8) として半透明のアクリル板で覆われている LED ライト パッドのプレートを配置します。注: は、実験の目的に応じて異なるメディアを使用します。注: 余分な熱を避けるためには、バックライトとしてに白熱灯や蛍光灯を使用しないでください。 2.1.1 説明 30 分給餌時間後、は、優しくきれいな人工海水残骸とぬけがら文化井戸からのキャリー オーバーを防ぐために (図 9) 24 ウェル プレートの 4 つの井戸の連続にピペッティングで各動物をすすいでください。 LED ライト パッドのプレート A と B の井戸で洗った個人を配置します。井戸に動物の調整のための 30 分を許可します。 (図 8) 調整期間中に板の上のカメラを設定します。三脚やスタンドを使用して、カメラを保持します。 プレート アンテナの観察を許可するように A の中の男性にピントします。注: 映画でバックライトのちらつきを減らすためには、フレーム レートに等しいまたは電気周波数の半分に設定しより長い露光時間を使用します。また、2.1.2 の手順で説明されているように半透明のアクリル板で覆われた LED ライト パッドをしてください。 2.1.4 の手順に従って調整期間の後、ビデオ録画および行動テストを開始します。 パスツール ピペットのプレートにプレート B からターゲットを転送します。実験中の化学成分に敏感な場合は、テストの各ペアのピペットを変更します。注: プレート B から動物をピペッティング時は追わないパスツール ピペットで水で水妨害できる動物を刺激するし、その過剰な動きを引き出します。水表面をやや上回るピペットの先端を押しながら個々 の先端の下に来るを待ちます。人工海水の少量をピペット優しくから取り出してプレート A. に井戸の中へ 実験計画に従って転送後観察の時間 (例えば10 分) の希望期間の各ウェルでやり取りをする男性とターゲットを許可します。 観測時間後ビデオの録画を停止します。必要に応じて、カメラから録画したムービーをコンピューターにダウンロードします。 3. マニュアル行動特性解析 各ターゲット板 A. 井戸に移されたとき、タイミングのための映画を調べる 開始し、関心のあるイベントの終了タイミングを調べ、時間、待機時間、およびイベントの頻度を計算します。 ターゲット (図 10、左上) の体のどの部分に男性のアンテナの接触として男性によってガードの試みの開始を定義します。触角の連絡先は、スウィフトによって頻繁に先行されて (< 0.5 s) を追いかけるか、襲い掛かります。 男性の両方のアンテナをターゲット (図 10、右上) の体から切り離すとき、ポイントとしてガードの試みの終了を定義します。警備として試行回数を計算します。 (図 10右下) 女性のそれに対する urosome の反復的なプレスが続いている男性の体背部ベンドして交尾の開始を定義します。プッシュの周波数は、1 秒あたり数回です。注: 警備の男性を交尾 (図 10、左下) の前に女性の体の尾下にクロールします。 3.2.4 に記載されているイベントの後、urosomes の剥離によって交尾の終了を定義します。注: 交尾一般的に起こるt. ミヤコカブリダニとt. ミヤコグサの場合に数分間。 4 個人やペアの次元の追跡 ムービー編集ソフトで手順 2 で記録映画をトリミングすることによって関心 (例えば最初の 3 s ガードの試み) のエピソードを備えたビデオ クリップを生成します。 インストールから ImageJ14 : https://imagej.nih.gov/ij/download.html。ダウンロードして MTrackJ、ImageJ15、モーショントラッ キングのプラグインで次の手順の: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/。 ImageJ を開き、目的のムービーをインポート (例えば、ファイル > インポート > を使用して QuickTime; 画像処理に必要なメモリを削減する「8 ビット グレースケール変換」を選択)。 空間と時間のキャリブレーションを実行します。 空間キャリブレーションの ImageJ ウィンドウでまっすぐの線選択ツールを選択します。 ムービー ウィンドウの既知の長さ (例えば井戸の直径) を持つオブジェクトに沿って選択線を描画します。 「縮尺の設定」メニューを開く (分析 > スケールを設定).「知られている距離」ボックスと「長さの単位」ボックスにそのユニット (mmなど) で既知長さを入力します。他のビデオ クリップのスケールを使用する「グローバル」チェック ボックスをクリックします。 「プロパティ」メニューを開く (画像 > プロパティ) 時間のキャリブレーションのため。「フレーム間隔」ボックスにフレーム間隔 (フレーム率の逆数) を入力します。 MTrackJ の追跡を構成します。 プラグインから MTrackJ プラグインを開く > ImageJ の MtrackJ。追跡を開く MTrackJ ダイアログ ウィンドウで「追跡」ボタンをクリックして設定メニュー。 「ポイントを追加した後次の時間インデックスを移動する」をチェックすることによって追跡間隔設定と構成] ダイアログ ボックスで”時間ステップ サイズ」ボックス数値を入力。フレーム単位で追跡を実行するには、「時間ステップ サイズ」ボックスに「”1″」と入力します。 「適用ローカル カーソル追跡時にスナップ」をチェックし、スナップ機能として「暗い重心」を選択します。このオプションは、カーソルを検出正方形 (「スナップの範囲」) の暗いオブジェクト (すなわち、個人またはペア) 重心の自動検出できます。全体のペアまたは映画 (例えば31 x 31 ピクセル) で動物をカバーする四角形のサイズを選択します。 選択したオプションを適用する”OK”をクリックします。 二次元の追跡を実行します。 追跡を開始する MTrackJ ダイアログ ウィンドウで「追加」ボタンをクリックしてします。 ペアまたは追跡する個人をカバーするカーソル (検出広場) を置きます。正方形内のオブジェクトの暗い重心を検出するをクリックします。 フレームの必要な数の 4.6.2 のステップを繰り返します。 データ テーブルを生成するには、MTrackJ ダイアログ ウィンドウで「測定」ボタンをクリックします。データは、2 つのウィンドウに表示されます:「MTrackJ: トラック」ウィンドウ軌跡を追跡の概要、「MTrackJ: ポイント」は、時期ごとの詳細なデータを示しています。各テーブルを保存するには、ファイルを選択 > ImageJ のメニューを付けて保存します。注: 各データ列の詳細については (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) の開発者によって提供されたオンライン マニュアルを参照してください。 色付きの線として描画履歴軌道ムービーを生成するには、MTrackJ ダイアログ ウィンドウで「ムービー」ボタンをクリックしてします。生成されたムービーを保存するファイルを選択 > ImageJ のメニューを付けて保存します。 全体の結果を保存します。データ (手順 4.6.4) と (手順 4.6.2 と 4.6.3) 軌跡を追跡を含む結果を保存する MTrackJ ダイアログ ウィンドウで「保存」ボタンをクリックしてします。