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Environment

Individuelle Kultivierung von Copepoden Tigriopus und Quantitative Analyse ihres Verhaltens Mate-Bewachung

Published: September 26, 2018
doi:
10.3791/58378
,
1Marine Biology Research Division, Scripps Institution of Oceanography,University of California, San Diego

Summary

Mate-Bewachung Verhalten spielt eine wichtige Rolle bei der Fortpflanzung der Gezeitenzone ruderfußkrebsen der Gattung Tigriopus. Methoden für das Studium dieses Verhalten wurden jedoch nicht gut beschrieben. Hier beschreiben wir Methoden für: (1) einzelne Kultur der Jungfrau Tigriopus Tiere und (2) Quantitative Analyse ihres Verhaltens Mate-Bewachung.

Abstract

Ruderfußkrebsen der Gattung Tigriopus, die gemeinsame Zooplankton in felsigen Gezeiten-Pools sind, zeigen Männchen Mate-Bewachung Verhalten, wo ein Mann drückt eine potentielle Partnerin um ein paar zu bilden. Während dieses Phänomen Interesse der Forscher angezogen hat, wurden Methoden für die Analyse nicht gut beschrieben. Hier beschreiben wir Verfahren für: (1) individuelle Kultivierung und Inszenierung von Tigriopus Jugendliche und Erwachsene und (2) Video-basierte Analyse ihres Verhaltens Mate bewachen. Die Kultivierung Methode ermöglicht experimentelle Kontrolle Gemüsemesser Erfahrung der Tiere sowie die Möglichkeit, ihre Entwicklung vor Verhaltensstörungen Tests verfolgen. Die Analysemethode ermöglicht quantitative Bewertung verschiedener Aspekte des Mate-Bewachung Verhaltens, einschließlich einzufangen Versuche von Männchen und Schwimmen Flugbahn des Mate-Bewachung Paare. Obwohl diese Methoden für ethologischen Studien über Tigriopusgegründet wurden, mit entsprechenden Änderungen können sie auch angewendet werden, Studien von anderen Zooplankton in verschiedenen Forschungsbereichen wie Physiologie, Toxikologie, und ökologische Genetik.

Introduction

Intertidal ruderfußkrebsen der Gattung Tigriopus sind in felsigen hohen intertidal Pools über mehrere Kontinente1verbreitet. Diese Copepoden Verhalten Mate-Bewachung als Teil ihrer Reproduktion, wo ein erwachsener Mann eine potentielle Partnerin (Jugendliche oder Erwachsene fängt) unter Verwendung seiner süchtig erste Antennen vor der Kopulation (Abbildung 1 und Abbildung 2)2 ,3,4,5. Obwohl dieses Phänomen ein Thema der ethologischen und biochemische Studien für Jahrzehnte2,3,6,7, detaillierte Verfahren für Studien über dieses Verhalten wurde, einschließlich individuelle Kultur der jungfräulichen Tiere und Kriterien des Verhaltens Begebenheiten in einem Mate-Bewachung Versuch, nicht gut beschrieben worden. So schaffen wir hier Methoden um Studien über das Verhalten unter einem kontrollierten experimentellen Umfeld zu ermöglichen.

Individuelle Kultivierung und Inszenierung von Tieren

Frühere Studien der Reproduktion von Tigriopus beschäftigt konventionell ein paar abnehmen Methode um Jugendliche (Copepodids) und adulte Weibchen für Verhaltensstörungen Tests vorzubereiten und Zucht Experimente3,8,9 ,10. Diese Methode ermöglicht jedoch Tiere Form Paare und potenziell vor Prüfungen (diskutiert in Ito 198811), kopulieren die Behaviorale Eigenschaften der Tiere5verändern kann. Darüber hinaus gibt es auch ein Potenzial, Entwicklungsstadien von Copepoden mit den herkömmlichen Protokollen zu verkennen, wie sie auf scheinbare Körpergröße für Inszenierung verlassen. In diesem Artikel beschreiben wir eine individuelle Kultivierung Methode in unserer aktuellen Studie mit Tigriopus Californicus5, die entworfen wurde, um diese Einschränkungen zu beheben, durch Paarung Erfahrung von Tieren zu kontrollieren und verfolgen ihre Entwicklung vom Copepodid zum adulten Stadien.

Quantitative Analyse der Mate-Bewachung Verhalten

Das Mate-Bewachung Verhalten der Tigriopus Arten ist untersucht worden, nicht nur auf dem Gebiet der Ethologie2,6 , sondern auch in anderen Bereichen der Ökotoxikologie und Evolutionäre Genetik3,4, 7 , 8 , 9 , 10. jedoch die Vorgängerstudien habe erklärt den Verlauf dieses Verhalten vor allem in geschrieben Formen ohne ausreichende visuelle Abbildungen zu skizzieren, das Verhalten und die Methoden zu studieren, die technischen Hindernisse für schafft die Replikation und Weiterentwicklung der Studien. Hier bieten wir detaillierte Beschreibungen von einigen der wichtigsten Ereignisse in der Mate-Bewachung Verhalten von Tigriopus Copepoden unterstützt durch visuelle Materialien. Wir zeigen auch Geräte und Methoden zur quantitativen Analyse des Verhaltens. Diese Methoden ermöglichen Bewertung des Verhaltens Eigenschaften von Tieren bei Mate-Bewachung versuchen genau replizierten Experimente.

Mit diesen Methoden wollen wir eine methodische Grundlage für kontrollierte und reproduzierbare Studien auf dem Mate-Bewachung Verhalten der Gattung Tigriopusbieten.

Protocol

1. Vorbereitung des jungfräulichen Tiere für Verhaltensbeobachtung Erhalten Sie befruchtete Eier zu und ermöglichen Sie ihnen zu schlüpfen. Trächtige Weibchen tragen klare Orange (d.h. befruchtete und in fortgeschrittenen Stadien der Entwicklung) Eier (Figur 3) aus einem Lager Kultur mit einer Pasteurpipette zu sammeln. Spülen Sie die Weibchen durch pipettieren sie sanft in sauberen Kulturmedium zu vermeiden Übertragung von anderen Tieren, einschließlich nauplial Larven, die geschlüpft sind, können in der Kultur.Hinweis: In diesem Protokoll wird künstliches Meerwasser mit einem Salzgehalt von 35 % als Nährmedium verwendet. Anderes Medium (z.B. künstliches Meerwasser mit einem höheren Salzgehalt oder eine zusätzliche gelösten) je nach Verwendungszweck eines Experiments zu verwenden.Hinweis: Siehe Barreto Et Al. 201512 für eine Methode zur Einrichtung der Labor-Kultur-Bestände und Pereira Et Al. 201613 Beispiele für Sammelstellen der natürlichen Populationen von T. Californicus. Peterson Et Al. berichteten auch ihre Sammelstellen von T. Californicus, T. Fulvusund T. Japonicus mit Längen- und Breitengrad Informationen9. Verwenden Sie Kunststoff Pipetten mit einer Kapazität von ca. 30-50 mL, um Copepoden Tigriopus von Fels-Pools zu sammeln. Legen Sie jedes Weibchen einzeln in einen Brunnen von einer 6-Well Kultur Zellplatte mit sauberen Kulturmedium (Abbildung 4, Links). Stellen Sie sicher, dass kein anderes Tier (einschließlich nauplial Larve) Brunnen verunreinigt ist. Pflegen Sie die Platten in einem Inkubator bei 20 ° C mit einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus auf die Weibchen Kultur bis sie Ei Sacs release festgelegt. Dieser Schritt dauert in der Regel ein bis zehn Tage je nach Spezies und Entwicklungsstadien des Embryos. Inzwischen jedes trächtige Weibchen zweimal in der Woche mit zwei Körner von fein Boden (etwa < 0,5 mm Durchmesser) Fischfutter füttern (siehe Tabelle der Materialien für Details).Hinweis: Verwenden Sie unterschiedliche Temperaturen und leichte Zyklen abhängig vom Zweck des Experiments. Höhere Temperaturen können eine schnellere Entwicklung der Embryonen erleichtern.Hinweis: Vermeiden Sie es überschüssige Lebensmittel verfallenden in Brunnen. Speisereste beginnt zu zerfallen, pipette es aus Brunnen mit einer Pasteurpipette. Nach Egg Sacs veröffentlicht sind, entfernen Sie die Weibchen aus den Kultur-Brunnen mit einer Pasteurpipette.Hinweis: Befruchteten Weibchen sind in der Lage, mehrere Gelege von Nachkommen2,3laichen. Bei Bedarf übertragen Sie die Weibchen in anderen Brunnen, weitere Kupplungen zu sammeln. Copepodids für einzelne Kultur zu sammeln. Halten Sie die Platten mit geschlüpften Nauplien im Inkubator und Kultur die Nauplien, bis sie an die erste Stufe der Copepodid (CI) (Abbildung 4, Mitte) zu entwickeln. Dieser Schritt dauert in der Regel ein bis zwei Wochen. Futtermittel jeweils gut mit mehreren Körner des fein gemahlenen Fischfutter bei der Suche nach CI Tiere einmal alle zwei Tage. Verdampftes Aufzucht Wasser mit destilliertem Wasser auffüllen.Hinweis: Wenn Treibgut die Sicht behindert, Überfliegen Sie es mit einem kleinen Stück Küchenpapier. Als CI Tiere beginnen zu entstehen, sammeln sie aus den Brunnen mit einem p-10 Mikropipette mit seiner pipettieren Datenträgersatz an ungefähr 8 µL, unter einem Stereomikroskop bei 10 X bis 40 X Vergrößerung (Abbildung 4, rechts). Waschen Sie jedes CI-Tier durch pipettieren sie sanft im sauberen künstliches Meerwasser und legen Sie sie in einen Brunnen von 24 Wohlen Kultur Zellplatte, 2-3 mm Tiefe (ca. 400-600 µL) künstliches Meerwasser enthält.Hinweis: Vermeiden Sie Übertrag nauplial Exuviae oder andere Tiere in die Vertiefungen für die individuelle Kultur. Verfolgen Sie die Entwicklung der Individuen durch zählen Exuviae gemausert. Innerhalb jedes gut für gemausert Exuviae alle zwei bis drei Tage (Frequenz einstellen, bei Bedarf) durch stereomicroscopic Beobachtung unter einem dunkel-Bereich Beleuchtung bei 10 X bis 40 X Vergrößerung untersuchen. Exuviae Copepodids sind transparent und erkennbar mit Borsten Beine, ein paar der kaudalen Rami (z. B. dünne abstehenden Strukturen am kaudalen Ende) und/oder Segmentierung der Prosome und Urosome (Abbildung 5). Ändern Sie Fokus und Beleuchtung, Exuviae in verschiedenen Tiefen in einem Brunnen (Abb. 6A) zu erkennen.Hinweis: Gemausert Exuviae sind kleiner als das Tier, das ihnen gemausert hat. Beginnen Sie Prüfung von geringerer Vergrößerung für ein Tier und seine relativ neue Exuviae und Verschiebung zu höheren Vergrößerung für ältere (d.h. kleiner) Exuviae.Hinweis: Wenn Exuviae in einem Brunnen beschädigt sind, beseitigen Sie den Brunnen vor weiteren Entwicklungsstörungen Tracking, Fehleinschätzung der Entwicklungsstadien zu vermeiden.Hinweis: Wenn Treibgut die Ansicht (Abb. 6 b) behindert, Überfliegen Sie es mit einem kleinen Stück Küchenpapier. Erfassen Sie eine Gesamtanzahl von Copepodid Exuviae, in jede Vertiefung mit einem Tally-Markierung auf dem Teller Deckel (Abbildung 7). Fügen Sie eine Zeile bis zur Markierung, wie eine neue Exuviae in den Brunnen zu finden ist.Hinweis: Wenn nauplial Exuviae in den Brunnen kontaminiert sind, beseitigen von der Zählung. Jedes einzelnen zu füttern, mit zwei Körner des fein gemahlenen Fischfutter. Füllen Sie verdunstetes Aufzucht Wasser mit destilliertem Wasser auf den Salzgehalt zu pflegen.Hinweis: Feed Copepodids alle zwei bis drei Tage zu verhindern, dass sie konsumieren und beschädigen Exuviae gemausert, die potenziell Schätzung der Entwicklungsstufe (Schritt 1.3.4) beeinflussen könnten. Entwicklungsstadium des Tieres anhand der Anzahl der Exuviae zu schätzen. Gibt es keine Exuviae, voraussichtlich die einzelnen CI sein. Gibt es ein bis vier Exuviae, dürfte die einzelnen CII CV Stufen sein. Gibt es fünf Exuviae, wird das Individuum geschätzt, ein Erwachsener. Geschlecht des Erwachsenen anhand der Morphologie zu identifizieren. Sex Tiere anhand ihrer Morphologie. Tigriopus Männchen besitzen gekniet erste Antennen mit Haken und kugelige Strukturen am distalen Ende (Abbildung 3A). Adulte Weibchen besitzen glattere und relativ dünner erste Antennen (Abb. 3 b) als die der Männchen. Manche Weibchen zeigen auch dunklen grüne Farbe aus Gonaden Lipid in ihren Körpern (Abb. 3 b, 3D). Markieren Sie das Geschlecht auf dem Deckel des Brunnens (Abb. 7 b). (2) Verhaltens Test und Video-Aufzeichnung der Mate-Bewachung Verhalten Wählen Sie auf einem Testtag Tiere der gewünschten Stufe und Sex für eine Verhaltens-Test. Füttern Sie die ausgewählten Personen in Kultur Brunnen mit fein Boden Fischfutter zu, und lassen sie es für 30 Minuten Essen. Unterdessen fahren Sie mit Schritt 2.1.2 Testkammern vorzubereiten. Bereiten Sie zwei 48-Well Flachboden Kultur Zellplatten als Test Kammern; eine Platte (nachstehend “Platte A”) ist für Männer und die andere (“Platte B”) ist für Ziele (z. B. Copepodids, adulte Weibchen, Männchen). Fügen Sie 400 µL sauber künstliches Meerwasser mit einem Salzgehalt von 35 % in Vertiefungen der Platten. Legen Sie die Platten auf ein LED Licht bedeckt mit einem durchscheinenden Acryl Board als leichte Diffusor (Abbildung 8).Hinweis: Verwenden Sie anderes Medium je nach Zweck des Experiments.Hinweis: Um überschüssige Wärme zu vermeiden, keine verwenden Sie Glühlampe oder Leuchtstoffröhren Lampen als Hintergrundbeleuchtung. Spülen Sie nach der 30-min Fütterungszeit in 2.1.1 beschrieben jedes Tier durch pipettieren sie sanft in eine Folge von vier Brunnen von einer 24-Well-Platte sauber künstliches Meerwasser (Abbildung 9), Verschleppung von Schutt und Exuviae aus Kultur Brunnen zu verhindern. Legen Sie die gespülten Individuen in den Vertiefungen der Platten A und B auf dem LED-Licht-Pad. Lassen Sie 30 Minuten für die Anpassung der Tiere in die Vertiefungen. Legen Sie eine Videokamera über Platte A während des Berichtigungszeitraums (Abbildung 8). Verwenden Sie ein Stativ oder ein Gestell, um die Kamera zu halten. Fokussieren Sie die Kamera auf die Männchen innerhalb der Platte A um eine Beobachtung der Antennen zu ermöglichen.Hinweis: Um Flimmern der Hintergrundbeleuchtung in Filmen zu verringern, legen Sie eine Frame-Rate entspricht oder die Hälfte eine elektrische Frequenz und verwenden Sie eine längere Belichtungszeit zu. Halten Sie auch das LED Licht Pad bedeckt mit einem durchscheinenden Acryl Board wie unter Punkt 2.1.2 beschrieben. Beginnen Sie nach der Eingewöhnungsphase in Schritt 2.1.4 beschriebenen video-Aufzeichnung und Verhaltensstörungen Test. Übertragen Sie die Ziele von Platte B auf Platte A mit einer Pasteurpipette. Wenn das Experiment empfindlich gegen chemische Komponenten im Medium ist, ändern Sie Pipetten für jedes Tests.Hinweis: Wenn ein Tier von der Platte B pipettieren, jagen sie nicht im Wasser mit einer Pasteurpipette Wasser Störung kann stimulieren das Tier und seine überschüssige Bewegung zu entlocken. Halten Sie eine Spitze der Pipette etwas oberhalb der Wasseroberfläche und warten auf den einzelnen unter die Spitze zu kommen. Pipette es sanft mit einer kleinen Menge von künstlichem Meerwasser und werfen Sie sie in einen Brunnen auf Platte A. Ermöglichen Sie nach ein Versuchsplan ein Männchen und ein Ziel in jede Vertiefung für einen gewünschten Zeitraum Beobachtungszeit (z.B. 10 Minuten) nach der Übertragung zu interagieren. Video Aufnahme beenden nach der Beobachtungszeit. Falls notwendig, herunterladen Sie aufgenommene Filme von der Kamera auf einen Computer. 3. manuelle Analyse des Verhaltens Eigenschaften Den Film für das Timing zu untersuchen, wenn jedes Ziel in den Brunnen auf Platte A. übertragen wurde Einleitung und Beendigung Timing der Ereignisse von Interesse zu untersuchen und Dauer, Latenz und Häufigkeit der Ereignisse zu berechnen. Einleitung der Bewachung Versuch von einem männlichen als Ansprechpartner des Männchens Antenne mit jedem Körperteil des Ziels (Abbildung 10, links oben) zu definieren. Der riechzentrum Kontakt ist oft eine rasche vorangestellt (< 0,5 s) zu jagen oder zu stürzen. Beendigung der Bewachung Versuch als einen Punkt zu definieren, wenn beide Antennen des Männchens aus dem Körper eines Ziels (Abbildung 10, oben rechts) trennen. Berechnen Sie die Frequenz der Versuche als Bewachung: Einleitung der Kopulation durch eine Biegung der dorsalen Körper eines Mannes, der gefolgt von einer sich wiederholenden Presse eine Urosome gegen die des Weibchens (Abbildung 10, unten rechts) zu definieren. Frequenz des Stoßes wird mehrmals pro Sekunde.Hinweis: Eine Bewachung männliche kriecht bis zum kaudalen Ende einer weiblichen Körper vor der Kopulation (Abbildung 10, unten links). Definieren Sie Beendigung der Kopulation durch Loslösung von der Urosomes nach den Ereignissen in 3.2.4 beschrieben.Hinweis: Kopulation erfolgt in der Regel für einige Minuten in Fällen von T. Californicus und T. Japonicus. (4) zweidimensionale Tracking von Einzelpersonen und Paare Generieren Sie einen Videoclip mit einer Episode von Interesse (z.B. die ersten 3 s einer Bewachung Versuch) durch Trimmen des Films, die in Schritt 2 mit Film-editing-Software aufgezeichnet. ImageJ14 aus zu installieren: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Dann laden Sie MTrackJ, ein Motion-Tracking Plugin für ImageJ15, durch folgende Anweisungen auf: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/. ImageJ öffnen und importieren Sie einen Film von Interesse (z. B. Datei > Importieren > Verwendung von QuickTime; wählen Sie “8-Bit-Graustufen konvertieren” Speicherbedarf für die Bildverarbeitung zu reduzieren). Durchführen Sie räumliche und zeitliche Kalibrierung. Wählen Sie im Fenster ImageJ zur räumlichen Kalibrierung Straight Line-Selection. Zeichnen Sie eine Auswahllinie entlang eines Objekts mit einer bekannten Länge (z. B. Durchmesser eines Brunnens) in das Filmfenster. Öffnen Sie das Menü “Set” (Analyze > Maßstab gesetzt). Geben Sie die bekannten Länge im Feld “Abstand bekannt” und seine Einheit (z.B. mm) im Feld “Längeneinheit”. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen “Global”, um den Maßstab für andere video-Clips zu verwenden. Öffnen Sie das Menü “Eigenschaften” (Bild > Eigenschaften) zur Zeit Kalibrierung. Geben Sie Frame-Intervall (Kehrwert der die Frame-Rate) im Feld “Frame-Intervall”. Konfigurieren Sie Verfolgung mit MTrackJ. Öffnen Sie das MTrackJ-Plugin Plugins > MtrackJ auf ImageJ. Klicken Sie im Dialogfenster MTrackJ öffnet eine Tracking auf “Tracking” Menü “Configuration”. Legen Sie eine Tracking Intervall prüfen “Move to nächste Zeitindex nach dem Punkt hinzufügen” und Eingabe einer Zahl im Feld “Größe des Zeitschritts” im Dialogfenster Konfiguration. Um Bild für Bild Tracking durchzuführen, geben Sie “1” im Feld “Größe des Zeitschritts”. “Apply lokale Cursor bei der Nachverfolgung ausrichten” und wählen Sie “Dunkle Zentroid” als eine Snap-Funktion. Diese Option ermöglicht eine automatische Erkennung der Schwerpunkt eines dunklen Objekts (d. h. eine natürliche Person oder ein paar) innerhalb einer Erkennung Quadrat (“Snap-Bereich”) um einen Cursor. Wählen Sie eine Größe des Platzes, um eine ganze Paar oder ein Tier im Film (z.B. 31 x 31 Pixel) zu decken. Klicken Sie auf “OK”, um die gewählten Optionen gelten. Durchzuführen Sie zweidimensionale Tracking. Klicken Sie auf die Schaltfläche “Hinzufügen” im Dialogfenster MTrackJ zu verfolgen. Legen Sie einen Cursor (Erkennung Quadrat) um ein paar oder eine Einzelperson zu verfolgenden abzudecken. Klicken Sie, um die dunklen Schwerpunkt des Objekts innerhalb des Quadrats zu erkennen. Wiederholen Sie Schritt 4.6.2 für eine gewünschte Anzahl von Frames. Um Tabellen zu erstellen, klicken Sie auf “Messen” im Dialogfenster MTrackJ. Die Daten werden in zwei Fenstern angezeigt: “MTrackJ: Tracks” Fenster zeigt eine Zusammenfassung der nachverfolgten zweidimensionale Bahn und “MTrackJ: Punkte” zeigt Detaildaten für jeden Zeitpunkt. Um jede Tabelle zu speichern, wählen Sie Datei > Save as… Menü auf ImageJ.Hinweis: Finden Sie Beschreibungen der einzelnen Spalten von Daten im Online-Handbuch zur Verfügung gestellt durch den Entwickler (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/). Um einen Film mit einer verfolgte Flugbahn als farbige Linie gezeichnet zu generieren, klicken Sie auf “Film” im Dialogfenster MTrackJ. Um die generierten Film zu speichern, wählen Sie Datei > Save as… Menü auf ImageJ. Das ganze Ergebnis zu speichern. Klicken Sie auf die Schaltfläche “Speichern” im MTrackJ Dialog zum Speichern der Ergebnisse einschließlich der Daten (Schritt 4.6.4) und die nachverfolgten zweidimensionale Flugbahn (Schritte 4.6.2 und 4.6.3).

Representative Results

Individuelle Kultivierung im Schritt 1 beschriebene Methode ermöglicht die Vorbereitung und Durchführung der jungfräulichen Tiere ohne vorherige Erfahrung der Paarung. Der Verhaltens-Test in Schritt 2 beschriebenen ermöglicht video-Aufzeichnung und Beobachtung des Verhaltens von Copepoden Tigriopus Mate bewachen. Die folgende Prüfung des aufgezeichneten Videos mit den in den Schritten 3 und 4 beschriebenen Methoden ermöglicht Quantitative Analyse verschiedener Aspekte des Verhaltens, die in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 11 zeigt einen Unterschied in der durchschnittlichen Dauer der Bewachung Versuche zwischen männlich-weiblich und männlich-männliche Paare von T. Californicus. Eine manuelle Analyse gezeigt, dass Mann-Mann-Paare relativ kürzeren Dauer der Paarung als Mann-Frau-Paare zeigten. Beispiele von Trajektorien verfolgt mit der Analysemethode werden in Abbildung 12 dargestellt, und ein repräsentatives Ergebnis der Geschwindigkeit Analyse ist in Abbildung 13dargestellt. Zweidimensionale räumlichen Nachverfolgung von neu gebildeten Bewachung Paare von T. Californicus ergab, dass Mann-Mann-Paare tendenziell höheren Geschwindigkeit als Mann-Frau-Paare in den ersten 3 s der Bewachung Versuche. Abbildung 1: Mate-Bewachung Verhalten in Tigriopus. (A) ein Männchen umklammert ein Jungtier (Copepodid) mit der ersten Antennen (gekennzeichnet durch blaue Pfeile). Bar = 1 mm. (B) einen Überblick über Mate-Bewachung Verhalten. Ein Mann versucht, ein Ziel-Individuum (links) zu erfassen und bildet ein paar mit ihm (Mitte). Im Stecker-Stecker und einige Paare männlich-weiblich endet ein Bewachung Versuch ohne Kopulation. Diese Zahl wurde aus Tsuboko-Ishii und Burton 20175geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Entwicklungsstadien des Tigriopus. Tigriopus Arten durchlaufen in der Regel sechs Nauplius Stufen (von NI, NVI), fünf Copepodid Stufen (von CI, CV) und ein adult-Stadium (CVI)16. Männchen machen Bewachung Versuche für Jugendliche ab einem frühen Stadium der Copepodids (CI T. Japonicus und T. Fulvus6,-17 ) und CII T. Californicus3sowie für Erwachsene beiderlei Geschlechts5 . Diese Zahl wurde aus Tsuboko-Ishii und Burton 20175geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Morphologie der Erwachsenen (T. Californicus). (A) Männchen. (B) erwachsenes Weibchen. (C) trächtigen erwachsenes Weibchen mit einem Ei Sac mit befruchteten und entwickelten (klare orange) Eier. (D) trächtigen erwachsenfrau mit einer Ei-Sac mit unbefruchteten oder unbebauten (dunkelgrün) Eier. Pfeile zeigen Ei Sacs. Bar = 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Gliederung der Vorbereitung auf die individuelle Kultur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5: Exuviae gemausert. (A) Exuviae von CI, CV Phasen eines einzelnen Tieres von T. Californicus. Bar = 1 mm. (B) Exuviae von CI, CV inszeniert in einer einzelnen Kultur gut. Weiße Ablagerungen ist Kot des Tieres in den Brunnen (nicht im Bild dargestellt) kultiviert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6: Suche nach Exuviae unter einem Stereomikroskop. Balken = 1 mm. (A) zentrale Änderung eines Stereomikroskops zur Erkennung von Exuviae in verschiedenen Tiefen. Magenta Pfeile zeigen fokussierte Exuviae und grauen Pfeile zeigen unkonzentriert Exuviae. Obere Bild konzentriert sich auf die linke Exuviae, die ist an der Unterseite des Brunnens versunkenen. Untere Bild konzentriert sich auf die richtigen Exuviae, die unter der mittleren Oberfläche schwimmt. (B) Bild oben zeigt ein Beispiel für Behinderung der Untersuchung durch den Schutt auf dem mittleren schwimmende. Ein grüner Pfeil zeigt einen Exuviae, versteckt unter den Trümmern. Bild unten zeigt ein Ergebnis der Oberflächenreinigung mit einem kleinen Stück Küchenpapier. Ein Exuviae (gekennzeichnet durch einen grünen Pfeil) ist nach der Reinigung sichtbar. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 7: Staging und Geschlechtsbestimmung von Tieren. Beispiele für die Anzahl der Exuviae und Geschlecht der Tiere auf ein Deckel einer Kultur Platte markieren. (A) ein Beispiel für einen Brunnen mit fünf Exuviae und ein ausgewachsenes Tier. Die Anzahl der Zeilen in der Tally-Markierung auf dem Deckel stellt die Anzahl der Exuviae, die in den Brunnen gefunden. Wenn die Anzahl der Exuviae fünf erreicht, das Geschlecht des Tieres ermittelt werden anhand der Morphologie der Antennen (siehe auch Abbildung 3). (B) ein Beispiel für einen markierten Deckel einer Kultur-Platte. Obere Zeilen enthalten ältere (CIV zu Erwachsenen) Tiere und unteren Reihen jünger (d. h. neu gesammelten) Tiere (CI, CIII). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 8: Behavioral Test Schema. Einstellungen für video-Aufzeichnung der Mate-Bewachung Verhalten (links) und eine Übersicht über Verhaltensstörungen Test (rechts). Diese Zahl wurde aus Tsuboko-Ishii und Burton 20175geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 9: Spülen von Tieren vor einer verhaltensbedingten Test Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 10: Definition von Ereignissen in der manuellen Analyse untersucht. Abbildungen von Ereignissen, die in Bezug auf Mate-Bewachung Versuch beobachtet. Namen der Ereignisse definiert und analysiert in Schritt 3 werden hervorgehoben. Veranstaltungen in eine gepunktete Linie eingeschlossen können nicht in einige Kumpel Bewachung Versuche beobachtet werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 11: Unterschied bei der Bewachung der Dauer zwischen männlich-weiblich und männlich-männliche Paare von T. Californicus. Jedes Dreiecksymbol stellt Daten aus ein paar getestet. Bars und Schnurrhaare vertreten mediane und interquartilbereich bzw.. Durchschnittliche Dauer der Einnahme war größer für Mann-Frau-Paare (männlich-weiblich (n = 22), Stecker-Stecker (n = 29); **p < 0,01 von Mann-Whitney U-Test). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 12: Bahnen von Paaren in den ersten drei Sekunden der Bewachung Versuche. Beispiele für verfolgte zweidimensionale Flugbahnen von männlich-weiblich (links) und Mann-Mann-Paare von T. Californicus(rechts). Punkte auf die Bahnen stehen Zeitpunkten (30 Bilder pro Sekunde). Balken = 10 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 13: Unterschied in mittlere Geschwindigkeit nach der Einleitung der Bewachung zwischen männlich-weiblich und männlich-männliche Paare von T. Californicus. Jedes Dreiecksymbol stellt Daten aus ein paar getestet. Bars und Schnurrhaare vertreten mediane und interquartilbereich bzw.. Durchschnittliche Geschwindigkeit des Paares in den ersten 3 s der Bewachung Versuche war größer für Mann-Mann-Paare (männlich-weiblich (n = 13), Stecker-Stecker (n = 35). ***p < 0,001 von Mann-Whitney U-Test). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Zusätzliche Abbildung 1: Wirkung der Behandlung auf das Verhalten der Tigriopusspülen. Jeder Kreis oder Dreieck-Symbol stellt Daten von einer getesteten Person oder Paar. Bars und Schnurrhaare vertreten mediane und interquartilbereich bzw.. Individuen in “gespült” und “nicht gespült” Gruppen wurden auf die gleiche Weise bearbeitet, außer dass die Gruppe “nicht gespült” nicht die Spülung Behandlung (Schritt 2.1.3) vor 30 Minuten Einstellzeit (Schritt 2.1.4) erleben. (A) durchschnittliche Geschwindigkeit des gespült Männchen tendenziell größer ist als die der Männer nicht gespült werden (gespült (n = 6), nicht gespült (n = 6), n.s.: kein signifikanter Unterschied festgestellt durch Mann-Whitney U test). Die Geschwindigkeit wurde gemessen, für 30 s basierend auf Videos aufgezeichnet, nach der Einstellung Zeit. (B) durchschnittliche Geschwindigkeit des gespült Weibchen tendenziell größer als die der Weibchen nicht gespült werden (gespült (n = 6), nicht gespült (n = 6), n.s.: kein signifikanter Unterschied festgestellt durch Mann-Whitney U test). Die Geschwindigkeit wurde gemessen, für 30 s basierend auf Videos aufgezeichnet nach der Einstellzeit nach Schritt 4 (tracking-Intervall = 0,5 s). (C) Häufigkeit der Bewachung Versuche für Paare von gespült Individuen größer war (gespült (n = 6), nicht gespült (n = 6). ** p < 0,01 von Mann-Whitney U-Test). (D) Dauer der Bewachung Versuche tendenziell größer sein für Paare von gespült Einzelpersonen (gespült (n = 6), nicht gespült (n = 6), n.s.: kein signifikanter Unterschied festgestellt durch Mann-Whitney U test). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Individuelle Kultivierung und Bestimmung von Bühne und sex

Hier haben wir die Methode in unseren vorherigen Studie5 , bereiten Sie natives Tigriopus Tiere mit ihrer Paarung Erfahrung während ihrer Entwicklung (Abbildung 4 und Abbildung 7) gesteuert. Wie Tigriopus Arten, als Modell Tiere in verschiedenen biologischen Bereichen wie Toxikologie16,18, ökologische Physiologie19,20,21 genutzt werden, und evolutionären Genetik13,22,23,24, hat diese Methode ein Potenzial, wertvolle ökologische und genetische Faktoren auf den Lebenszyklus von diesen Copepoden beurteilen können.

Um erfolgreiche Inszenierung, normale Suche und Sammlung von CI zu erreichen ist Copepodids aus einer Massenkultur (Schritt 1.2) kritisch, da Sammlung in einem späteren Stadium in MIS Inszenierung der Tiere führen kann. Darüber hinaus ist eine gründliche Suche nach Exuviae (Schritt 1.3) auch für präzise Inszenierung. Erhöhen Sie die Häufigkeit der Sammlung und Inszenierung falls erforderlich, da das Intervall zwischen den Häutungen von einem bis zu mehreren Tagen je nach Art variiert und Zustand2,25,26Aufzucht. Unterschiede in der Morphologie der Antennen zwischen Copepodids und adulte Weibchen sind nicht sichtbar in einigen Arten und Populationen von Tigriopus16,25signifikant. Inszenierung vor Geschlechtsbestimmung ist daher hilfreich, adulte Weibchen von fortgeschrittenen Copepodids beiderlei Geschlechts zu unterscheiden.

Verhaltens-Tests und manuelle Analyse des Verhaltens Eigenschaften

Im Allgemeinen ist eines der wichtigsten Teile der ethologischen Studien Definition und Beschreibung der Ereignisse von Interesse. In diesem Papier eingeführten Methoden wurden zuerst für unsere jüngsten Studie5 entwickelt und ergänzt mit der Beschreibung der Kopulation und Sehhilfen (Abbildung 10). Konsistenz im Umgang mit Tieren spielt darüber hinaus auch eine wichtige Rolle in Verhaltensexperimente. Zum Beispiel Spülen von Copepoden kann potenziell ermöglichen einige Aspekte ihres Verhaltens (ergänzende Abbildung1) und ist daher wünschenswert, in konsistenter Weise zwischen Proben, wie z. B. im Schritt 2.1.3 standardisiert durchgeführt werden. Wir erwarten, dass das Material in diesem Dokument kontrollierte und reproduzierbare Studien über das Mate-Bewachung Verhalten der Tigriopus, Förderung der reproduktiven und ökologische Studien über diese reichlich Bewohner der hohen Gezeiten-Pools unterstützen werden.

Eine mögliche Einschränkung bei dieser Methode ist geringer Vergrößerung der erhaltenen Bilder. Obwohl Filme mit unserem System prominente Körperstrukturen, einschließlich Urosomes und männliche erste Antennen ermöglichen, eine möglicherweise nicht in der Lage, weitere subtilen Strukturen wie Beine und Genitalien mit unserer Methode zu beobachten, da es nicht beschäftigt Mikroskopische Vergrößerung für Videoaufnahmen. Während Kelly Et Al. berichteten, dass sie Spermatophore übertragen von Männchen auf Weibchen von T. Japonicus unter eine mikroskopische Beobachtung bei 100 X Vergrößerung (kein Video aufgezeichnet) beobachten konnten7, wir konnten nicht zu beobachten, eine Spermatophore in unseren Filmen, vielleicht aufgrund der Begrenzung der Bildauflösung.

Zweidimensionale Tracking von Paaren

Obwohl diese Methode keine dreidimensionalen Verfolgung von Tieren erlaubt, ermöglicht es zweidimensionale Flugbahn Analyse von Zooplankton ohne chemisch Kennzeichnung Tiere (Cf. Schmalz Et Al. 201027) durch die Verwendung von Programmen, die kostenlos verteilt. Wenn die Größe der Filmdatei in ImageJ verarbeitet werden zu groß ist, kann man verringern Sie die Auflösung der Datei und wandeln es in ein Graustufen-Film. Während die beschriebene Methode ursprünglich für Erwachsene Paare von T. Californicus (Abb. 12 und Abb. 13) entwickelt wurde, ist es auch für Erwachsene-Jugendliche Paare und Einzelpersonen (ergänzende Abbildung1) als auch andere Tigriopus Arten im Prinzip. Weiter erwarten wir die Methode, die für kurzfristige (aus der Millisekunde, die zweite Zeitskalen) geltenden Flugbahn Analyse von Zooplankton des anderen Taxa mit entsprechenden Anpassungen sein.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird unterstützt durch Zuschüsse aus der Sumitomo Foundation, Japan (Grant für grundlegende Wissenschaft Forschungsprojekte gewähren Nummer: 150932) und Research Institute von Wirbellosen Meerestieren, Japan (2018 individuelle Forschungsstipendium) STI RSB und einen Zuschuss aus den USA National Science Foundation (DEB-1556466), RSB. Wir danken Frau Kiana Michelle Woodward für Feedback über die Kultivierung und staging-Methode.

Materials

Instant Ocean Sea Salt Spectrum Brands. Inc. SS1-160P For preparation of culture medium
PRO PlecoWafers Tetra 16447 Food for copepods (used after being ground in a mortar)
Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid Corning Co., Ltd. 353224 Container for culture of gravid females and hatched nauplii
Flat bottom 24-well cell culture plate with lid Corning Co., Ltd. 353226 Container for individual culturing
Flat bottom 48-well cell culture plate with lid Nest Biotechnology Co., Ltd. 748001 Behavioral observation chambers
LED light pad Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. Litup LP4 Backlight for behavioral observation
Camera Canon 0591C003 (model: Rebel T6i) For recording of behavior
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A For transfer of copepods
P10 micropipette tips VWR 613-0735 For transfer of C1 stage copepodids
ImageJ NIH Version 1.49t For semi-automatic analysis of movies
MTrackJ Version 1.5.1 ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands)
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References

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Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior. J. Vis. Exp. (139), e58378, doi:10.3791/58378 (2018).
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