Culture individuelle de Tigriopus copépodes et analyse Quantitative de leur comportement Mate-gardiennage

1. préparation des animaux vierge pour l’Observation comportementale Obtenir des oeufs fécondés et leur permettre d’éclore. Recueillir des femelles gravides transportant des oeufs orange clair (c.-à-d., fécondés et à un stade avancé de développement) (Figure 3) d’une culture de réserve avec une pipette Pasteur. Rincer les femelles en leur pipetage doucement en milieu de culture propre pour éviter le transfert d’autres animaux, comme des larves de nauplial qui peuvent ont éclos dans la culture.Nota : Dans le présent protocole, l’eau de mer artificielle avec une salinité de 35 % est utilisé comme milieu de culture. Utilisez le support différents (par exemple eau de mer artificielle avec une salinité plus élevée ou un soluté supplémentaire), selon le but d’une expérience.Remarque : Voir Barreto et coll. 201512 pour une méthode de mise en place des stocks de culture de laboratoire et Pereira et coll. 201613 pour obtenir des exemples de sites de collecte des populations naturelles de T. californicus. Peterson et al a aussi déclaré leurs sites de collecte de T. californicus, fulvus T.et T. japonicus avec la latitude et la longitude d’information9. Utiliser pipettes en plastique d’une capacité d’environ 30-50 mL pour recueillir des copépodes Tigriopus de piscines Rocheuses. Placer chaque femelle individuellement dans un puits d’une plaque de culture de cellules de 6 puits avec milieu de culture propre (Figure 4, gauche). Assurez-vous qu’aucun autre animal (y compris les larves nauplial) ne contamine les puits. Maintenir les plaques dans un incubateur fixé à 20 ° C, avec un cycle lumière-obscurité de 12 heures à la culture les femelles jusqu’à ce qu’ils libèrent les ovisacs. Cette étape prend généralement d’un à dix jours selon les espèces et stades de développement des embryons. Pendant ce temps, nourrir chaque femelle gravide deux fois par semaine avec deux grains de nourriture pour poissons finement au sol (environ < 0,5 mm de diamètre) (voir la Table des matières pour plus de détails).Remarque : Utilisez des températures différentes et des cycles de lumière selon le but d’une expérience. Des températures plus élevées peuvent faciliter un développement plus rapide des embryons.Remarque : Évitez de laisser l’excès de nourriture en décomposition dans les puits. Si les débris de nourriture commencent à se désintégrer, il Pipetter hors puits avec une pipette Pasteur. Après que ovisacs sont libérés, supprimer les femelles provenant des puits de culture avec une pipette Pasteur.Remarque : Les femelles inséminées sont capables de frai plusieurs griffes de progéniture2,3. Le cas échéant, transférer les femelles dans les autres puits pour recueillir les autres griffes. Recueillir les copépodites de la culture individuelle. Garder les plaques avec des nauplies écloses dans l’incubateur et la culture les nauplies jusqu’à ce qu’ils développent au premier stade copépodite (CI) (Figure 4, milieu). Cette étape prend généralement d’une à deux semaines. Chacun avance bien avec quelques grains de la finement moulu nourriture pour poissons tout en cherchant des animaux CI une fois tous les deux jours. Ravitailler en eau d’élevage évaporée avec l’eau distillée.Remarque : Si des débris flottants fait obstacle à la vue, survolez avec un petit morceau de papier absorbant. Dès que les animaux CI commencent à émerger, collectionnent des puits avec une micropipette de P-10 avec son volume de pipetage fixé à environ 8 µL, sous un stéréomicroscope à 10 X à 40 X (Figure 4, droit). Lavez chaque animal CI par pipetage il doucement dans l’eau de mer propre et placez-le dans un puits de la plaque de culture cellulaire de 24 puits contenant de 2 à 3 mm de profondeur (environ 400-600 µL) d’eau de mer artificielle.Remarque : Évitez de transporter sur des exuvies nauplial ou d’autres animaux dans les puits pour culture individuelle. Suivre l’évolution des individus en comptant les exuvies muées. Examiner l’intérieur de chaque puits d’exuvies muées chaque deux ou trois jours (régler la fréquence si nécessaire) par l’observation des sous un éclairage de fond noir 10 X à 40 X. Exuvies de copépodites sont transparentes et reconnaissable avec les poils des jambes, une paire de rames caudales (c.-à-d., mince qui dépassent les structures à l’extrémité caudale), et/ou segmentation du prosome et urosome (Figure 5). Changer le focus et l’illumination pour détecter les exuvies à différentes profondeurs dans un puits (Figure 6 a).Remarque : Les exuvies muées sont plus petits que l’animal qui a mué eux. Entreprendre l’examen de plus faible grossissement un animal relativement récente exuvies et Maj d’à un grossissement supérieur pour plus âgés exuvies (c.-à-d., plus petit).Remarque : Si les exuvies dans un puits sont endommagés, éliminer le puits de plus amples développement suivi pour éviter l’erreur de jugement de stades de développement.Remarque : Si des débris flottants fait obstacle à la vue (Figure 6 b), lait écrémé avec un petit morceau de papier absorbant. Enregistrer un nombre total d’exuvies de copépodite dans chaque puits avec une marque de pointage sur le couvercle de la plaque (Figure 7). Ajoutez une ligne au trait comme un nouveau exuvies se trouve dans le puits.Remarque : S’il y a nauplial exuvies contaminés dans le puits, éliminer du comte. Nourrir chacun avec deux grains de la finement moulu nourriture pour poissons. Ravitailler en eau d’élevage évaporée avec l’eau distillée pour maintenir la salinité.Remarque : Nourrir les copépodites tous les deux ou trois jours pour les empêcher de consommer et d’endommager les exuvies muées, qui pourraient potentiellement influencer estimation du stade de développement (étape 1.3.4). Évaluer le stade de développement de l’animal selon le nombre des exuvies. S’il n’y a aucun exuvies, l’individu est estimé au stade de la CI. S’il y a des exuvies d’un à quatre, l’individu est estimé au CII aux stades de CV. S’il y a cinq exuvies, l’individu est estimé à un adulte. Identifier le sexe des adultes selon la morphologie. Sexe des animaux en examinant leur morphologie. Les mâles adultes de Tigriopus possèdent géniculés premières antennes avec crochet structures globulaires à l’extrémité distale (Figure 3 a). Les femelles adultes possèdent des antennes plus lisses et relativement mince premiers (Figure 3 b) que celles des mâles. Certaines femelles présentent également une couleur vert foncé de lipides gonadique dans leur corps (Figure 3 b, 3D). Marquer le sexe sur le couvercle du puits (Figure 7 b). 2. comportement Test et l’enregistrement vidéo du comportement Mate-gardiennage Une journée de test, sélectionnez animaux de scène désirée et le sexe pour un test comportemental. Nourrir les personnes choisies dans les puits de culture avec finement les aliments de poissons de fond et laissez-les manger pendant 30 minutes. Pendant ce temps, passer au point 2.1.2 pour préparer les chambres de tests. Préparer deux plaques de culture cellulaire fond plat 48-bien que le test des chambres ; une plaque (ci-après dénommée « plaque A ») est pour les hommes et l’autre (« plaque B ») pour cibles (par exemple copépodites, les femelles adultes, adultes de sexe masculin). Ajouter 400 µL d’eau de mer propre avec une salinité de 35 % dans les puits des plaques. Placer les plaques sur un tapis de lumière LED recouvert d’une planche acrylique translucide comme un diffuseur de lumière (Figure 8).Remarque : Utiliser un médium différent selon un but de l’expérience.Remarque : Pour éviter les excès de chaleur, n’utilisez pas de lampes incandescentes ou fluorescentes comme un rétro-éclairage. Après le temps d’alimentation 30 min décrit à la section 2.1.1, rincer chaque animal par pipetage doucement il en une succession de quatre puits d’une plaque de 24 puits rempli d’eau de mer propre artificielle (Figure 9) pour éviter le report des débris et des exuvies des puits de culture. Placer les individus rincés dans les puits de plaques A et B sur la rampe de lumière LED. Comptez 30 mn pour le réglage des animaux dans les puits. Définissez une caméra vidéo au-dessus de la plaque A au cours de la période d’ajustement (Figure 8). Utilisez un trépied ou un pied pour tenir la caméra. Concentrer la caméra sur les mâles à l’intérieur de la plaque A pour permettre une observation des antennes.Remarque : Pour réduire le scintillement de l’éclairage dans les films, définissez une cadence égale à ou la moitié d’une fréquence électrique et utiliser un plus long temps d’exposition. Aussi, gardez la touche lumière LED recouverte d’une planche acrylique translucide comme indiqué au point 2.1.2. Après la période d’ajustement décrite à l’étape 2.1.4, démarrer l’enregistrement vidéo et le test comportemental. Transférer les cibles de plaque B à plaque A avec une pipette Pasteur. Si l’expérience est sensible aux composants chimiques dans le milieu, changer des pipettes pour chaque paire d’essai.Remarque : Lors du pipetage un animal de la plaque B, ne pas chasser il dans l’eau avec une pipette Pasteur comme perturbation de l’eau peut stimuler l’animal et obtenir son mouvement excessif. Tenez une extrémité de la pipette légèrement au-dessus de la surface de l’eau et attendez que la personne à venir sous la pointe. Pipetez doucement vers le haut avec une petite quantité d’eau de mer artificielle et puis l’éjecter dans un puits sur la plaque d’a. Selon un plan d’expérience, permettent un mâle et une cible d’interagir dans chaque puits pour une période souhaitée du temps d’observation (par exemple 10 minutes) après le transfert. Arrêter l’enregistrement vidéo après l’heure de l’observation. Si nécessaire, télécharger les films enregistrés de l’appareil à un ordinateur. 3. Manuel analyse des propriétés comportementales Examiner le film pour le moment, quand chaque cible a été transféré dans le puits sur plaque d’a. Examiner l’initiation et le moment de la cessation des événements d’intérêt et de calculer la durée, temps de latence et la fréquence des événements. Définir début de tentative de garde par un mâle comme point de contact de l’antenne du mâle avec toute partie du corps de la cible (Figure 10, en haut à gauche). Le contact antennaire est souvent précédé d’une swift (< 0,5 s) courir ou bondir. Définir résiliation de tentative de garde comme un point lorsque les deux antennes du mâle se détachent du corps d’une cible (Figure 10, coin supérieur droit). Calculer la fréquence de se prémunir des tentatives comme : Initiation de la copulation pour définir une courbure dorsale d’un mâle qui est suivie d’une presse répétitive d’un urosome contre celui de la femelle (Figure 10, bas à droite). Fréquence de la push est plusieurs fois par seconde.Remarque : Un mâle garde rampe jusqu’à l’extrémité caudale du corps de la femelle avant la copulation (Figure 10, en bas à gauche). Define cessation de la copulation par détachement de l’urosomes après les événements décrits dans 3.2.4.Remarque : Copulation a généralement lieu pendant plusieurs minutes dans le cas de T. californicus et T. japonicus. 4. deux dimensions suivi des individus et des couples Générer un clip vidéo mettant en vedette un épisode d’intérêt (par exemple les 3 premiers s d’une tentative de garde) en taillant le film enregistré à l’étape 2 avec le logiciel de montage de film. Installer ImageJ14 à partir de : https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Ensuite, téléchargez MTrackJ, un plugin de motion-tracking pour ImageJ15, en suivant les instructions sur : https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/. Ouvrez ImageJ et importer un film d’intérêt (par exemple, fichier > Importer > à l’aide de QuickTime ; choisissez « Convertir 8 bits en niveaux de gris » pour réduire la mémoire requise pour le traitement de l’image). Procéder au calage spatial et temporelle. Sélectionnez l’outil de sélection de ligne droite dans la fenêtre de ImageJ pour calibration spatiale. Tracer une ligne de sélection le long d’un objet avec une longueur connue (par exemple le diamètre d’un puits) dans la fenêtre film. Ouvrez le menu « Set Scale » (Analyze > échelle définie). Entrez la longueur connue dans la boîte de « Distance connue » et de son appareil (p. ex. mm) dans la boîte de « Unité de longueur ». Cochez la case « Global » pour utiliser l’échelle pour les autres clips vidéo. Ouvrez le menu « Propriétés » (Image > Propriétés) pour l’étalonnage de l’heure. Entrez intervalle de trame (inverse de la fréquence d’images) dans la zone « Intervalle de trame ». Configurer le suivi avec MTrackJ. Ouvrez le plugin MTrackJ de Plugins > MtrackJ sur ImageJ. Cliquez sur le bouton « Tracking » dans la fenêtre de dialogue de MTrackJ pour ouvrir un suivi le menu de configuration. Définir un intervalle de suivi en cochant « Déplacer vers le prochain index de temps après l’ajout de point » et en entrant un nombre dans la zone « Temps étape taille » dans la fenêtre de dialogue de configuration. Pour effectuer le suivi de l’image par image, inscrivez « 1 » dans la zone « Taille d’étape de temps ». Cochez « Apply local cursor claquer lors du suivi » et choisissez « Centroïde sombre » comme un élément de composant logiciel enfichable. Cette option permet une détection automatique du centre de gravité d’un objet sombre (c’est-à-dire, une personne ou un couple) dans un carré de détection (« plage de composant logiciel enfichable ») autour d’un curseur. Choisissez une taille de la place pour couvrir un entier pair ou l’animal dans le film (par exemple 31 x 31 pixels). Cliquez sur « OK » pour appliquer les options choisies. Effectuer le suivi des deux dimensions. Cliquez sur le bouton « Ajouter » dans la fenêtre de dialogue MTrackJ pour commencer le suivi. Placer un curseur (place de détection) pour couvrir une paire ou un individu à être l’objet d’un suivi. Cliquez ici pour détecter le centroïde sombre de l’objet dans le carré. Répétez l’étape 4.6.2 une quantité désirée de trames. Pour générer des tables de données, cliquez sur « Mesure » dans la fenêtre de dialogue de MTrackJ. Les données sont affichées dans deux fenêtres : fenêtre « MTrackJ : Tracks » présente un état récapitulatif de la trajectoire de deux dimensions sur chenilles et « MTrackJ : Points » présente des données détaillées pour chaque point dans le temps. Pour enregistrer chaque tableau, choisissez Fichier > Enregistrer sous… menu sur ImageJ.Remarque : Reportez-vous au manuel en ligne fourni par le développeur (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) pour obtenir une description de chaque colonne de données. Pour générer un film avec une trajectoire de chenilles dessinée comme une ligne colorée, cliquez sur le bouton « Movie » dans la fenêtre de dialogue de MTrackJ. Pour enregistrer le film généré, choisissez Fichier > Enregistrer sous… menu sur ImageJ. Enregistrez le résultat complet. Cliquez sur le bouton « Enregistrer » dans la fenêtre de dialogue MTrackJ pour enregistrer les résultats, y compris les données (étape 4.6.4) et la trajectoire de deux dimensions sur chenilles (points 4.6.2 et 4.6.3).