استزراع الفردية الكانفاس تيجريوبوس والتحليل الكمي لسلوكهم حراسة ماتي
Summary
السلوك حراسة رفيقه دوراً هاما في مجال الإنجاب الكانفاس المدية من جنس تيجريوبوس. ومع ذلك، لم تكن أساليب لدراسة هذا السلوك وصفاً جيدا. هنا يصف لنا طرق: 1) الفردية ثقافة العذراء تيجريوبوس الحيوانات و 2) التحليل الكمي لسلوكهم حراسة رفيقه.
Abstract
الكانفاس جنس تيجريوبوس، وهي العوالق الحيوانية المشتركة في برك المد والجزر الصخرية، إظهار سلوك حراسة ماتي بريكوبولاتوري حيث ذكر إقفال رفيقه محتملة لتشكيل زوج. في حين أن هذه الظاهرة قد جذبت اهتمام الباحثين، لم تكن أساليب للتحليل وصفاً جيدا. هنا يمكننا وصف إجراءات: استزراع 1) الفردية والتدريج تيجريوبوس الأحداث والبالغين، وتحليل سلوكهم حراسة رفيقه 2) القائم على الفيديو. طريقة تثقيف يمكن التحكم التجريبية للتقشير خبرة الحيوانات، فضلا عن القدرة على تتبع تطورها قبل الاختبارات السلوكية. يسمح أسلوب تحليل التقييم الكمي لعدة جوانب من السلوك حراسة ماتي، بما في ذلك الاستيلاء على محاولات من جانب الذكور والسباحة مسار من حراسة ورفيقه أزواج. على الرغم من أن هذه الأساليب قد أنشئت أساسا للدراسات اثولوجيكال في تيجريوبوس، مع إجراء التعديلات المناسبة يمكن أيضا تطبيقها على دراسات العوالق الأخرى في المجالات البحثية المختلفة، مثل علم وظائف الأعضاء، علم السموم، والإيكولوجية علم الوراثة.
Introduction
الكانفاس المدية من جنس تيجريوبوس توزع على نطاق واسع في برك المد العالية الصخرية عبر عدة قارات1. هذه الكانفاس يحمل رفيقه حراسة السلوك كجزء من تكاثرها، حيث ذكر بالغ يلتقط رفيقه محتملة (الأحداث أو الكبار) الاستفادة هوائيات أول مدمن مخدرات قبل الجماع(الشكل 1 و الشكل 2)2 3، ،،من45. ورغم أن هذه الظاهرة كانت موضوعا لدراسات اثولوجيكال والبيوكيميائية لعقود2،3،،من67، إجراءات مفصلة لإجراء دراسات لهذا السلوك، بما في ذلك لم تكن الثقافة الفردية للحيوانات العذراء والمعايير السلوكية الأحداث ينظر في محاولة حراسة رفيقه، وصفاً جيدا. وهكذا، هنا نقوم بإنشاء طرق لتمكين الدراسات المتعلقة السلوك في ظل بيئة تجريبية تسيطر عليها.
استزراع الفردية والتدريج من الحيوانات
الدراسات السابقة لاستنساخ تيجريوبوس المستخدمة تقليديا زوج فصل أسلوب إعداد الأحداث (كوبيبوديدس) والإناث البالغات للاختبارات السلوكية وتربية تجارب3،8،9 ،10. ومع ذلك، هذا الأسلوب يسمح الحيوانات على شكل أزواج، ويحتمل أن تكون جامع قبل الاختبارات (نوقشت في عام 1988 إيتو11)، التي قد تغير من الخصائص السلوكية للحيوانات5. وبالإضافة إلى ذلك، هناك أيضا إمكانية نخطئ مراحل النمو من الأرجل مع البروتوكولات التقليدية كما أنها تعتمد على حجم الجسم الظاهر التدريج. في هذه الورقة، ويصف لنا طريقة تثقيف فردية المستخدمة في دراستنا الأخيرة مع الكاليفورني تيجريوبوس5، الذي صمم لمعالجة هذه القيود عن طريق التحكم في تجربة الأقران للحيوانات وتتبع تطورها من كوبيبوديد إلى مراحل الكبار.
التحليل الكمي للسلوك حراسة ماتي
ودرست سلوك حراسة ماتي تيجريوبوس الأنواع ليس فقط في مجال الأخلاقيات2،6 ولكن أيضا في مجالات أخرى مثل علم السموم الإيكولوجية وعلم الوراثة التطوري3،4، 7 , 8 , 9 , 10-ومع ذلك، أوضحت الدراسات السابقة مسار هذا السلوك أساسا في كتب النماذج دون الرسوم التوضيحية المرئية كافية لتحديد السلوك والأساليب دراستها، مما يخلق عقبات تقنية النسخ المتماثل، والنهوض بالدراسات. هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لبعض الأحداث الرئيسية في سلوك حراسة ماتي الكانفاس تيجريوبوس تدعمها المواد البصرية. كما نبدي معدات وأساليب للتحليل الكمي للسلوك. تسمح هذه الطرق تقييم الخصائص السلوكية للحيوانات أثناء محاولات حراسة رفيقه في دقة التجارب المنسوخة نسخاً متماثلاً.
مع هذه الأساليب ونحن نهدف إلى توفير أساس منهجية للدراسات التي تسيطر عليها واستنساخه على سلوك رفيقه حراسة من جنس تيجريوبوس.
Protocol
Representative Results
Discussion
استزراع الفردية وتحديد المرحلة والجنس
هنا يمكننا وصف الطريقة المستخدمة في أعمالنا السابقة دراسة5 إعداد العذراء تيجريوبوس الحيوانات مع خبرتهم الأقران يسيطر حين تتبع تطورها (رقم 4 و رقم 7). كما تستخدم الأنواع تيجريوبوس كالحيوانات النموذجية في مختلف المجالات البيولوجية مثل علم السموم16،18، الفسيولوجيا البيئية19،،من2021، والتطوري الوراثة13،22،،من2324، إمكانات هذا الأسلوب لتوفير وسيلة قيمة لتقييم تأثير العوامل البيئية والوراثية في دورة حياة هذه الأرجل.
لتحقيق الانطلاق الناجح والبحث العادية وجمع CI كوبيبوديدس من ثقافة جماعية (الخطوة 1، 2) أمر بالغ الأهمية، كما جمع في مراحل لاحقة قد يؤدي سوء التدريج الحيوانات. وباﻹضافة إلى ذلك، بحث شامل عن اكسوفياي (الخطوة 1.3) ضروري أيضا التدريج دقيقة. زيادة تواتر جمع والتدريج إذا لزم الأمر، كما يختلف الفاصل بين مولتس من يوم واحد إلى عدة أيام تبعاً للأنواع وتربية الشرط2،،من2526. الاختلافات بين كوبيبوديدس والإناث البالغات في مورفولوجيا هوائيات ليست كبيرة واضح في بعض الأنواع والسكان من تيجريوبوس16،25. ومن ثم التدريج قبل sexing مفيدة التمييز بين الإناث البالغات من كوبيبوديدس متقدمة من أي من الجنسين.
الاختبارات السلوكية ودليل تحليل الخصائص السلوكية
وبوجه عام، واحدة من أهم أجزاء من دراسات اثولوجيكال هو تعريف ووصف للأحداث ذات الأهمية. طرق عرض في هذه الورقة أولاً وضعت لنا الدراسة الأخيرة5 وتستكمل مع وصف الجماع والمعينات البصرية (الشكل 10). وبالإضافة إلى ذلك، الاتساق في التعامل مع الحيوانات أيضا دوراً هاما في التجارب السلوكية. على سبيل المثال، الشطف من الأرجل قد يحتمل أن تيسر بعض جوانب سلوكهم (تكميلية الشكل 1) ولذلك من المستحسن يجب القيام بها بطريقة متسقة بين العينات، مثل النظام الموحد في خطوة 2.1.3. أننا نتوقع من المواد المقدمة في هذه الورقة سوف تساعد الدراسات التي تسيطر عليها واستنساخه في سلوك حراسة ماتي تيجريوبوس، تشجيع الدراسات الإنجابية والإيكولوجية لهذا ساكن وفيرة في برك المد العالي.
حد ممكن واحد مع هذا الأسلوب تضخم منخفضة للصور التي تم الحصول عليها. على الرغم من أن الأفلام المسجلة مع نظامنا يسمح تحديد هياكل هيئة بارزة بما في ذلك أوروسوميس وهوائيات أول الذكور، واحد قد لا قادراً على مراقبة هياكل خفية أكثر مثل الساقين، والأعضاء التناسلية مع أسلوب لدينا نظراً لأنها لا تستخدم التكبير المجهري لتسجيل الفيديو. في حين أفادت كيلي وآخرون أنها قادرة على مراقبة سبيرماتوفوري نقل من الذكور إلى الإناث من japonicus ت تحت ملاحظة مجهرية في 100 X التكبير (لا الفيديو المسجل)7، ونحن لم تكن قادرة على مراقبة سبيرماتوفوري في الأفلام لدينا، ربما بسبب الحد دقة وضوح الصورة.
تتبع ثنائي الأبعاد لأزواج
على الرغم من أن هذا الأسلوب لا يسمح بتتبع ثلاثي الأبعاد للحيوانات، يمكن تحليل مسار ثنائي الأبعاد من العوالق الحيوانية دون كيميائيا وسم الحيوانات (cf. شحم الخنزير وآخرون 201027) عن طريق استخدام البرامج التي توزع مجاناً. إذا كان حجم ملف الفيلم كبير جداً بحيث تتم معالجتها في إيماجيج، يمكن للمرء تقليل دقة الملف وتحويله إلى فيلم تدرج رمادي. بينما وصف الطريقة التي وضعت أصلاً للكبار أزواج الكاليفورني ت. (رقم 12 و رقم 13)، كما أنها متاحة لأزواج الأحداث الكبار والأفراد واحد (تكميلية الشكل 1) كما فضلا عن غيرها من الأنواع تيجريوبوس من حيث المبدأ. ونتوقع كذلك الأسلوب الذي يتم تحليل المسار تنطبق على المدى القصير (من ميلي ثانية إلى المقاييس الزمنية الثانية) من العوالق الحيوانية الأصناف الأخرى مع إجراء التعديلات المناسبة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة سوميتومو، اليابان (منحة “مشاريع بحوث العلوم الأساسية” ومنح رقم: 150932) و “معهد أبحاث من اللافقريات البحرية”، اليابان (منحة بحثية فردية 2018) للأمراض المنقولة جنسياً و RSB، ومنحة من الولايات المتحدة مؤسسة العلوم الوطنية (ديب-1556466) إلى RSB. ونشكر السيدة عاشق الريم ميشيل وودوارد لردود الفعل على طريقة تثقيف والتدريج.
Materials
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
| PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
| Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
| Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
| Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
| LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
| Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
| P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
| ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
| MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |
References
- Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus. Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).
- Fraser, J. H. The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).
- Burton, R. S. Mating system of the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 86 (3), 247-252 (1985).
- Lazzaretto, I., Salvato, B., Libertini, A. Evidence of chemical signaling in Tigriopus fulvus (copepoda, harpacticoida). Crustaceana. 59 (2), 171-179 (1990).
- Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Sex-specific rejection in mate-guarding pair formation in the intertidal copepod, Tigriopus californicus. PLoS ONE. 12 (8), e0183758 (2017).
- Ito, T. The biology of a harpacticoid copepod, Tigriopus japonicus Mori. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Series 4, Zoology. 17 (3), 474-500 (1970).
- Kelly, L. S., Snell, T. W., Lonsdale, D. J. Chemical communication during mating of the harpacticoid Tigriopus japonicus. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 353 (1369), 737-744 (1998).
- Kelly, L. S., Snell, T. W. Role of surface glycoproteins in mate-guarding of the marine harpacticoid Tigriopus japonicus. Marine Biology. 130 (4), 605-612 (1998).
- Peterson, D. L., et al. Reproductive and phylogenetic divergence of tidepool copepod populations across a narrow geographical boundary in Baja California. Journal of Biogeography. 40 (9), 1664-1675 (2013).
- Palmer, C. A., Edmands, S. Mate choice in the face of both inbreeding and outbreeding depression in the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 136 (4), 693-698 (2000).
- Ito, T. Taxonomy within the genus Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida) from Japan, with reference to the relationship between Tigriopus japonicus and T. californicus. Annual report of the Seto Marine Biological Laboratory. 2, 28-35 (1988).
- Barreto, F. S., Schoville, S. D., Burton, R. S. Reverse genetics in the tide pool: Knock-down of target gene expression via RNA interference in the copepod Tigriopus californicus. Molecular Ecology Resources. 15 (4), 868-879 (2015).
- Pereira, R. J., Barreto, F. S., Pierce, N. T., Carneiro, M., Burton, R. S. Transcriptome-wide patterns of divergence during allopatric evolution. Molecular Ecology. 25 (7), 1478-1493 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Raisuddin, S., Kwok, K. W., Leung, K. M., Schlenk, D., Lee, J. S. The copepod Tigriopus: a promising marine model organism for ecotoxicology and environmental genomics. Aquatic Toxicology. 83 (3), 161-173 (2007).
- Lazzaretto, I., Franco, F., Battaglia, B. Reproductive behaviour in the harpacticoid copepod Tigriopus fulvus. Hydrobiologia. 292, 229-234 (1994).
- Medina, M. H., Morandi, B., Correa, J. A. Copper effects in the copepod Tigriopus angulatus Lang. Marine and Freshwater Research. 59 (12), 1061-1066 (1933).
- McDonough, P. M., Stiffler, D. F. Sodium regulation in the tidepool copepod Tigriopus californicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 69 (2), 273-277 (1981).
- Hagiwara, A., Lee, C. -. S., Shiraishi, D. J. Some reproductive characteristics of the broods of the harpacticoid copepod Tigriopus japonicus cultured in different salinities. Fisheries Science. 61 (4), 618-622 (1995).
- Pereira, R. J., Sasaki, M. C., Burton, R. S. Adaptation to a latitudinal thermal gradient within a widespread copepod species: the contributions of genetic divergence and phenotypic plasticity. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284 (1853), 20170236 (2017).
- Barreto, F. S., Pereira, R. J., Burton, R. S. Hybrid dysfunction and physiological compensation in gene expression. Molecular Biology and Evolution. 32 (3), 613-622 (2015).
- Alexander, H. J., Richardson, J. M., Edmands, S., Anholt, B. R. Sex without sex chromosomes: genetic architecture of multiple loci independently segregating to determine sex ratios in the copepod Tigriopus californicus. Journal of Evolutionary Biology. 28 (12), 2196-2207 (2015).
- Foley, B. R., Rose, C. G., Rundle, D. E., Leong, W., Edmands, S. Postzygotic isolation involves strong mitochondrial and sex-specific effects in Tigriopus californicus, a species lacking heteromorphic sex chromosomes. Heredity. 111 (5), 391-401 (2013).
- Koga, F. On the Life History of Tigriopus japonicus Mori (Copepoda). Journal of Oceanography. 26 (1), 11-21 (1970).
- Powlik, J. J. Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78 (2), 467-481 (1998).
- Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. Tracking the small with the smallest – Using nanotechnology in tracking zooplankton. PLoS ONE. 5 (10), e13516 (2010).
