Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones
Summary
En este estudio, presentamos un protocolo para realizar dos fotones intravital proyección de imagen y de la célula análisis de interacción en la mucosa traqueal murina después de la infección con virus de la gripe. Este Protocolo será relevante para los investigadores que estudian la dinámica celular inmune durante las infecciones respiratorias.
Abstract
El análisis de célula o célula-patógeno interacción en vivo es una herramienta importante para entender la dinámica de la respuesta inmune a la infección. Dos fotones microscopía intravital (2P-IVM) permite la observación de las interacciones de la célula en tejidos profundos en animales vivos, reduciendo al mínimo el fotoblanqueo generado durante la adquisición de la imagen. Hasta la fecha, se han descrito distintos modelos de 2P-IVM de órganos linfoides y no linfoides. Sin embargo, la proyección de imagen de órganos respiratorios sigue siendo un reto debido al movimiento asociado con el ciclo de la respiración del animal.
Aquí, describimos un protocolo para visualizar en vivo la célula inmune interacciones en la tráquea de ratones infectados con el virus de la influenza usando 2P-IVM. Para ello, hemos desarrollado una plataforma de proyección de imagen personalizada, que incluía la exposición quirúrgica y la intubación de la tráquea, seguida por la adquisición de imágenes dinámicas de neutrófilos y células dendríticas (DC) en el epitelio de la mucosa. Además, detallan los pasos necesitados para llevar a cabo la gripe intranasal infección y flujo análisis cytometric de células inmunes en la tráquea. Finalmente, se analizaron del neutrófilo y motilidad de DC así como sus interacciones en el transcurso de una película. Este protocolo permite la generación de imágenes de 4D estable y brillante es necesario para la evaluación de las interacciones célula-célula en la tráquea.
Introduction
Dos fotones microscopía intravital (2P-IVM) es una técnica eficaz para proyección de imagen en tiempo real de las interacciones célula a célula que se producen en su entorno natural1. Una de las principales ventajas de este método es que permite el estudio de procesos celulares en una mayor profundidad de la muestra (500 μm a 1 mm) en comparación con otras técnicas por imágenes tradicionales2. Al mismo tiempo, el uso de dos fotones de baja energía generada por el láser de dos fotones reduce el foto-daño de tejido por lo general asociado con el proceso de adquisición de imagen2. Durante la última década, 2P-IVM ha sido aplicado para estudiar diferentes tipos de interacciones célula-célula en varias disciplinas3,4,5. Estos estudios han sido especialmente relevantes para investigar las células inmunes, que se caracterizan por su alto dinamismo y la formación de destacados contactos siguiendo las señales generadas por otras células y el medio ambiente. 2P-IVM se ha aplicado también para estudiar las interacciones entre el patógeno y huésped6. De hecho, se ha demostrado previamente que algunos patógenos pueden alterar el tipo y la duración de los contactos entre las células inmunes, dificultando, en consecuencia, la respuesta inmune7.
La mucosa de las vías respiratorias es el primer sitio en el que la respuesta inmune contra patógenos aerotransportados es generado por la8. Por lo tanto, en vivo análisis de las interacciones patógeno-host en este tejido es fundamental para entender la iniciación de los mecanismos de defensa del huésped durante la infección. Sin embargo, 2P-IVM de las vías respiratorias es difícil principalmente debido a los artefactos producidos por el ciclo de respiración de los animales, que compromete el proceso de adquisición de la imagen. Recientemente, se han descrito diferentes modelos quirúrgicos para imagen tráquea murino9,10,11,12 y pulmones13,14,15, 16. Modelos traqueal P 2-IVM representan una excelente configuración para visualizar la fase inicial de la reacción inmunitaria en las vías aéreas superiores, mientras que el pulmón alvéolos 2P-IVM modelos son más adecuados para el estudio de la fase tardía de infecciones. Los modelos de pulmón desarrollados presentan una limitación asociada a la presencia de alvéolos llenos de aire, que restringen la penetración óptica del láser y la capa mucosa de las vías aéreas intrapulmonares inaccesibles para el en vivo de17 . Por el contrario, la estructura de la tráquea, formada por un epitelio continuo, facilita la adquisición de la imagen.
Aquí, presentamos un protocolo que incluye una descripción detallada de los pasos necesarios para realizar la infección por influenza, preparación quirúrgica de los animales y 2P-IVM de la tráquea. Además, se describe un montaje experimental específico para la visualización de los neutrófilos y las células dendríticas (DC), dos tipos de células inmunes que juegan un papel importante como mediadores de lo mecanismo de defensa contra influenza virus18,19 . Por último, se describe un procedimiento para analizar las interacciones del neutrófilo-DC. Estos contactos se ha demostrado que modulan la activación de la DC y, posteriormente, afectar la respuesta inmune contra patógenos20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo presenta un protocolo detallado para la generación de imágenes de 4D que muestra la migración de neutrófilos eventualmente transferidos y sus interacciones con DC durante una infección de gripe en la tráquea de ratón. El modelo descrito P 2-IVM será relevante para el estudio de dinámica celular inmune durante una infección en las vías respiratorias.
Recientemente, varios modelos basados en la visualización de la dinámica de la célula en las vías respiratorias han si…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las donaciones de la Fundación Nacional Suiza (SNF) (176124 145038 y 148183), europeo Marie Curie reintegración subvención de la Comisión (612742) y SystemsX.ch para una beca a D.U.P. (2013/124).
Materials
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1X) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20°C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20°C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20°C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
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