La formazione immagine interazione cellula nella Mucosa trachea durante l'infezione da Virus influenzale usando la microscopia Intravital due-fotone
Summary
In questo studio, presentiamo un protocollo per eseguire due-fotone videomicroscopia imaging e cella analisi di interazione nella mucosa trachea murino dopo infezione con virus dell’influenza. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che studiano la dinamica delle cellule immuni durante le infezioni respiratorie.
Abstract
L’analisi della cellula-cellula o cellula-patogeno interazione in vivo è uno strumento importante per capire la dinamica della risposta immunitaria all’infezione. Due-fotone microscopia intravital (2P-IVM) permette l’osservazione delle interazioni cellula nei tessuti profondi in animali viventi, riducendo al minimo il photobleaching generati durante l’acquisizione di immagini. Ad oggi, sono stati descritti diversi modelli per 2P-IVM degli organi linfoidi e non linfoidi. Tuttavia, la formazione immagine degli organi respiratori rimane una sfida a causa del movimento associata al ciclo di respirazione dell’animale.
Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare in vivo delle cellule immuni interazioni nella trachea di topi infettati con il virus dell’influenza utilizzando 2P-IVM. A questo scopo, abbiamo sviluppato una piattaforma di formazione immagine personalizzata, che comprendeva l’esposizione chirurgica e intubazione della trachea, seguita dall’acquisizione di immagini dinamiche dei neutrofili e cellule dendritiche (DC) nell’epitelio mucoso. Inoltre, abbiamo dettagliato i passaggi necessari per eseguire l’influenza intranasale infezione e flusso cytometric analisi delle cellule immuni nella trachea. Infine, abbiamo analizzato il neutrofilo e motilità DC così come le loro interazioni nel corso di un film. Questo protocollo permette per la generazione di immagini 4D stabile e luminose necessario per la valutazione delle interazioni cellula-cellula nella trachea.
Introduction
Due-fotone microscopia intravital (2P-IVM) è una tecnica efficace per l’imaging di tempo reale delle interazioni cellula-cellula che si verificano nel loro ambiente naturale1. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che permette lo studio di processi cellulari, a una maggiore profondità di campione (500 µm a 1 mm), rispetto ad altri di tecniche di imaging tradizionale2. Allo stesso tempo, l’uso di due fotoni di bassa energia generata dal laser del due-fotone minimizza il foto-danno di tessuto tipicamente associato con il processo di acquisizione immagine2. Durante l’ultimo decennio, 2P-IVM è stato applicato per lo studio di diversi tipi di interazioni cellula-cellula in diverse discipline3,4,5. Questi studi sono stati particolarmente rilevanti per indagare le cellule immuni, che sono caratterizzate dalla loro alta dinamicità e la formazione di importanti contatti seguendo i segnali generati da altre cellule e l’ambiente. 2P-IVM è stata applicata anche per studiare le interazioni tra patogeno e serie6. Infatti, precedentemente è stato indicato che alcuni agenti patogeni possono alterare il tipo e la durata dei contatti tra le cellule immunitarie, ostacolando, di conseguenza, la risposta immunitaria7.
La mucosa delle vie aeree è il primo sito in cui la risposta immunitaria contro agenti patogeni nell’aria è generato8. Pertanto, in vivo l’analisi delle interazioni agente patogeno-ospite in questo tessuto è fondamentale per comprendere l’iniziazione dei meccanismi di difesa ospite durante l’infezione. Tuttavia, 2P-IVM delle vie aeree è impegnativo pricipalmente dovuto i manufatti prodotti dal ciclo di respirazione dell’animale, che compromette il processo di acquisizione di immagini. Recentemente, sono stati descritti diversi modelli chirurgici per imaging trachea murino9,10,11,12 e polmoni13,14,15, 16. Tracheale 2P-IVM modelli rappresentano un ottimo set-up per visualizzare la fase iniziale della reazione immune nelle vie aeree superiori, mentre sono più adatti a studiare la fase tarda di infezioni del polmone-alveoli 2P-IVM modelli. I modelli sviluppati del polmone presentano una limitazione associata alla presenza degli alveoli riempiti d’aria, che limitano la penetrazione ottica del laser e rendere lo strato della mucosa delle vie aeree intrapolmonari inaccessibile per in vivo imaging17 . Al contrario, la struttura della trachea, formata da un epitelio continuo, facilita l’acquisizione di immagini.
Qui, presentiamo un protocollo che include una descrizione dettagliata dei passaggi necessari per eseguire l’infezione di riossidazione, preparazione chirurgica degli animali e 2P-IVM della trachea. In più, descriviamo un specifico set-up sperimentale per la visualizzazione dei neutrofili e cellule dendritiche (DC), due tipi di cellule immunitarie che svolgono un ruolo importante come mediatori del meccanismo di difesa contro l’influenza virus18,19 . Infine, descriviamo una procedura per analizzare le interazioni del neutrofilo-DC. Questi contatti sono stati indicati per modulare l’attivazione delle DC e, successivamente, di influenzare le risposte immunitarie contro gli agenti patogeni20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro presenta un protocollo dettagliato per la generazione di immagini 4D che mostrano la migrazione dei neutrofili passivamente trasferiti e loro interazioni con DC durante un’infezione influenzale nella trachea del mouse. Il modello descritto 2P-IVM saranno rilevante per studiare la dinamica delle cellule immuni durante un’infezione delle vie aeree.
Recentemente, diversi modelli basati sulla visualizzazione delle dinamiche delle cellule delle vie aeree sono stati sviluppati<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni della Fondazione nazionale svizzero (SNF) (176124, 145038 e 148183), l’europeo Commissione Marie Curie per il reinserimento (612742) e il SystemsX.ch una sovvenzione di D.U.P (2013/124).
Materials
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1X) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20°C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20°C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20°C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
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